方案摘要：本方案结合Pipetty电动移液器精准控量、连续移液、操作稳定、防交叉污染的核心优势，规范马流感HI（血凝抑制）实验中样品处理、抗原稀释、反应体系配制等关键操作环节，有效规避手动移液易出现的移液误差、操作效率低下、样品交叉污染等问题。充分发挥该移液器移液精准度高、重复性强、操作便捷的特点，保障实验结果的准确性、一致性和可靠性，为马流感的快速、精准检测提供标准化操作依据。适用于动物疫病防控机构、兽医实验室等开展马流感血清抗体检测工作，助力提升检测工作的效率与质量。
 
方案详情：
一、实验原理
马流感病毒（EIV，主要为H3N8亚型）表面含有血凝素，可与鸡红细胞表面的受体结合，使鸡红细胞发生凝集。当存在马流感特异性抗体时，抗体可与病毒HA结合，阻止HA与鸡红细胞受体的结合，从而抑制红细胞凝集。通过倍比稀释血清，测定能完全抑制4个HA单位病毒凝集的血清最高稀释倍数，即为该血清的HI抗体效价，以此判断样品中马流感抗体的存在及含量，为马流感感染诊断提供依据。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 离心机；
③ 振荡器。
 
2、试剂和材料
① 96孔V型或U型微量反应板；
② PBS；
③ 1%鸡红细胞悬液；
④ H3N8亚型EIV灭活抗原；
⑤ H3N8亚型EIV阳性血清和阴性血清(商品化试剂)。
 
 
三、实验步骤
1、用Pipetty电动移液器吸取150μL待检血清，加入无菌微量离心管中。更换吸头，吸取300μL新配制的0.016mol/L过碘酸钾溶液，加入血清中，自动混匀模式，混匀，置于22℃±2℃环境中作用15min。再次吸取150μL 3%甘油PBS，加入离心管中，混匀后继续置于22℃±2℃环境中作用15min，中和过剩的过碘酸钾。将离心管放入恒温水浴锅，56℃水浴灭活30min，灭活后取出，冷却至室温，备用。
2、对H3N8亚型EIV灭活抗原进行HA效价检测。
3、稀释抗原，使含量为4个HA单位(4×HA最小凝集量)。
4、使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，吸取25μL PBS缓冲液，加入96孔微量反应板各孔中。
 
5、连续分液模式，吸取25μL预处理后的待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清，分别加入反应板每行的第1孔中，更换吸头，进入混匀模式，用移液器吹吸5次混匀，然后单次吸取25μL转移至第2孔，混匀，依次倍比稀释至第11孔，第11孔混匀后吸取25μL弃去；第12孔不加血清，仅加PBS和抗原，作为空白对照。
6、连续分液模式，吸取25μL 4个HA单位的抗原，加入反应板每孔中，轻轻振荡混匀，置于22℃±2℃环境中孵育30min。
 
7、用Pipetty连续分液模式吸取50μL 1%鸡红细胞悬液，加入反应板每孔中，轻轻振荡混匀，置于22℃±2℃环境中孵育30min；
8、将反应板倾斜45°角，保持20-30s，观察鸡红细胞凝集抑制情况。
9、观察反应板各孔，若沉淀的鸡红细胞向下滑动，呈流线状，无红细胞凝集现象，说明HA反应被完全抑制，以能完全抑制4个HA单位抗原的血清最高稀释倍数，作为该血清的HI抗体效价。
 
四、结果判定
1、结果成立条件
阳性对照血清的HI效价与已知效价相差不超过1个滴度;阴性对照血清HI效价小于1:8。
2、阳性
HI效价不低于1:8,判定为EIV抗体阳性。
3、阴性
HI效价小于1:8,判定为EIV抗体阴性。