Pipetty电动移液器在猪水疱病RT-PCR实验中的应用
2026-03-20 来源:广州程淇生物 点击次数:18
方案摘要： 本方案旨在明确Pipetty电动移液器在猪水疱病（SVD）RT-PCR检测实验中的具体应用，规范实验操作流程，包括核酸提取、RT-PCR反应体系配制、扩增产物检测等关键步骤。相较于传统手动移液器，Pipetty电动移液器具备突出的连续分液优势，可实现单次吸液、多次精准分液，有效避免手动反复吸液导致的体积误差，同时降低长时间操作带来的手部疲劳，大幅提升移液效率；其精准的体积控制的能力，能有效规避手动移液器因人为按压力度不均、操作手法差异造成的移液偏差，进一步提高实验重复性和检测准确性，为猪水疱病的快速、精准诊断提供标准化操作依据。
方案详情：
一、实验原理
猪水疱病（SVD）是由猪水疱病病毒（SVDV）引起的一种急性、接触性传染病，其核酸为单股正链RNA。本实验采用RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）技术，首先通过逆转录酶将SVDV的RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，利用特异性引物扩增SVDV的特异性基因片段（目标片段大小154bp）。
二、实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR仪；
③ 台式高速冷冻离心机；
④ 稳压稳流电泳仪；
⑤ 水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像仪(或紫外透射仪)；
⑦ 核酸提取仪；
⑧ 无核酸酶的离心管与吸头；
⑨ PCR扩增管；
⑩ 1.5mL离心管。
2、试剂和材料
① 引物:上游引物为 5-TTCAGAATGATTGCATATGGGG-3',
下游引物为5'-TCACGTTT-GTCCAGGTTACY-3'；
② 核酸提取试剂；
③ 酚-氯仿法试剂；
④ 无核酸酶水；
⑤ RT-PCR反应试剂:一步法RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR 酶混合液(含反转录酶、Tag酶和RNase抑制剂等)；
⑥ 电泳缓冲液；
⑦ 琼脂糖；
⑧ 电泳加样缓冲液；
⑨ DNA分子质量标准。
三、实验步骤
1、选用酚-氯仿法、RNA提取试剂盒、自动化核酸提取仪等方式进行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步骤:
a)用Pipetty电动移液器取待检样本、阴性对照、阳性对照各300μL，分别置于1.5mL无核酸酶离心管中，每管加入300μL变性液异硫氰酸胍或Trizol试剂，反复轻轻混匀，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸钠（pH4.0），轻轻混匀；
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，冰浴5min；
D）8000r/min离心10min，将上清液转入另一洁净离心管;
e)加800μL异丙醇，混匀，室温放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，离心10 min,倒掉上清液，尽量倒干液体，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(体积分数)乙醇颠倒洗涤沉淀，4℃，10 000r/min,离心5min。倒干液体,室温干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty连续分液模式，每管加10μL无核酸酶水，用于溶解RNA。总RNA提取液可立即用于RT-PCR扩增，也可置于-70℃冰箱储存备用。
2、为每个样品准备RT-PCR混合物，推荐为待检的批量样品整批准备扩增预混合体系为宜，并按照样本数n+2+1准备反应体系。
3、RT-PCR检测扩增预混合体系为:
---------12.5μL 2×一步法RT-PCR反应缓冲液;
---------1μL RT-PCR 酶混合液;
---------0.5μL上游引物10μmol/L;
---------0.5μL下游引物10μmol/L;
---------6.5μL无核酸酶水。
在已分装有RT-PCR预混合体系的PCR扩增管中，分别加入4μL已提取的总RNA，盖紧管盖，振荡混匀后，瞬时离心。
4、将PCR扩增管放入PCR仪中，按照设定程序进行RT-PCR扩增:50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；然后94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40个循环；最后72℃ 10 min。反应结束后,扩增产物置于4℃保存。
5、扩增产物电泳检测:制备2%琼脂糖凝胶，对RT-PCR扩增产物进行电泳，同时加DNA分子质量标准。电压80 V~100 V或电流40mA~50mA，电泳20min~30min。电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪(或紫外透射仪)观察。
6、试验成立条件：阳性对照应出现154bp大小的特异性扩增条带，阴性对照无扩增条带。
四、结果判定
符合实验成立条件，待检样品扩增出特异性条带，且与阳性对照条带分子质量大小相符,则该待检样品判定为SVDV核酸阳性。待检样品无扩增条带，判为SVDV核酸阴性。在需要时，可取RT-PCR扩增产物进行序列测定，测序结果与SVDV特异性片段序列进行比对。
方案详情：
一、实验原理
猪水疱病（SVD）是由猪水疱病病毒（SVDV）引起的一种急性、接触性传染病，其核酸为单股正链RNA。本实验采用RT-PCR（逆转录-聚合酶链反应）技术，首先通过逆转录酶将SVDV的RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，利用特异性引物扩增SVDV的特异性基因片段（目标片段大小154bp）。
二、实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR仪；
③ 台式高速冷冻离心机；
④ 稳压稳流电泳仪；
⑤ 水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像仪(或紫外透射仪)；
⑦ 核酸提取仪；
⑧ 无核酸酶的离心管与吸头；
⑨ PCR扩增管；
⑩ 1.5mL离心管。
2、试剂和材料
① 引物:上游引物为 5-TTCAGAATGATTGCATATGGGG-3',
下游引物为5'-TCACGTTT-GTCCAGGTTACY-3'；
② 核酸提取试剂；
③ 酚-氯仿法试剂；
④ 无核酸酶水；
⑤ RT-PCR反应试剂:一步法RT-PCR反应缓冲液、RT-PCR 酶混合液(含反转录酶、Tag酶和RNase抑制剂等)；
⑥ 电泳缓冲液；
⑦ 琼脂糖；
⑧ 电泳加样缓冲液；
⑨ DNA分子质量标准。
三、实验步骤
1、选用酚-氯仿法、RNA提取试剂盒、自动化核酸提取仪等方式进行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步骤:
a)用Pipetty电动移液器取待检样本、阴性对照、阳性对照各300μL，分别置于1.5mL无核酸酶离心管中，每管加入300μL变性液异硫氰酸胍或Trizol试剂，反复轻轻混匀，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸钠（pH4.0），轻轻混匀；
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，冰浴5min；
D）8000r/min离心10min，将上清液转入另一洁净离心管;
e)加800μL异丙醇，混匀，室温放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，离心10 min,倒掉上清液，尽量倒干液体，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(体积分数)乙醇颠倒洗涤沉淀，4℃，10 000r/min,离心5min。倒干液体,室温干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty连续分液模式，每管加10μL无核酸酶水，用于溶解RNA。总RNA提取液可立即用于RT-PCR扩增，也可置于-70℃冰箱储存备用。
2、为每个样品准备RT-PCR混合物，推荐为待检的批量样品整批准备扩增预混合体系为宜，并按照样本数n+2+1准备反应体系。
3、RT-PCR检测扩增预混合体系为:
---------12.5μL 2×一步法RT-PCR反应缓冲液;
---------1μL RT-PCR 酶混合液;
---------0.5μL上游引物10μmol/L;
---------0.5μL下游引物10μmol/L;
---------6.5μL无核酸酶水。
在已分装有RT-PCR预混合体系的PCR扩增管中，分别加入4μL已提取的总RNA，盖紧管盖，振荡混匀后，瞬时离心。
4、将PCR扩增管放入PCR仪中，按照设定程序进行RT-PCR扩增:50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；然后94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40个循环；最后72℃ 10 min。反应结束后,扩增产物置于4℃保存。
5、扩增产物电泳检测:制备2%琼脂糖凝胶，对RT-PCR扩增产物进行电泳，同时加DNA分子质量标准。电压80 V~100 V或电流40mA~50mA，电泳20min~30min。电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪(或紫外透射仪)观察。
6、试验成立条件：阳性对照应出现154bp大小的特异性扩增条带，阴性对照无扩增条带。
四、结果判定
符合实验成立条件，待检样品扩增出特异性条带，且与阳性对照条带分子质量大小相符,则该待检样品判定为SVDV核酸阳性。待检样品无扩增条带，判为SVDV核酸阴性。在需要时，可取RT-PCR扩增产物进行序列测定，测序结果与SVDV特异性片段序列进行比对。
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