方案摘要：本方案整合Pipetty电动移液器精准控量、连续移液、操作稳定以及防交叉污染等核心优势，对马流感SRH（单向辐射溶血试验）实验中的样品处理、抗原稀释、反应体系配制等关键操作环节予以规范化。此举能够有效规避手动移液过程中易出现的移液误差、操作效率低下以及样品交叉污染等问题。充分发挥该移液器移液精准度高、重复性强、操作便捷的特性，确保实验结果的准确性、一致性与可靠性，为马流感的快速、精准检测提供标准化操作的依据。该方案适用于动物疫病防控机构、兽医实验室等开展马流感血清抗体检测工作，有助于提升检测工作的效率与质量。
 
 
方案详情：
一、实验原理
马流感SRH（单向辐射溶血试验）是基于抗原-抗体-补体反应的血清学检测方法，核心原理为：马流感病毒（H3N8亚型EIV）致敏绵羊红细胞后，与待检血清中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，该复合物可激活补体系统，导致致敏绵羊红细胞发生溶血反应，形成肉眼可见的溶血圈。溶血圈的大小与血清中特异性抗体的含量呈正相关，通过测量溶血圈面积，可判定待检血清中马流感抗体的阳性与否，进而实现马流感的血清学检测。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 离心机；
③ 恒温箱；
④ 微波炉；
⑤ 水浴锅；
⑥ 振荡器；
⑦ 湿盒；
⑧ 游标卡尺。
 
2、试剂和材料
① 96孔V型或U型微量反应板；
② 盐水/HEPES；
③ 绵羊红细胞液;
④ 盐水/HEPES/BSA；
⑤ H3N8亚型EIV活病毒。
⑥ 氯化铬工作液；
⑦ PBS“A”；
⑧ 1%琼脂糖；
⑨ 补体，商品化豚鼠补体，或豚鼠血清；
⑩ 阳性血清和阴性血清；
⑪ 免疫扩散平板或平皿(直径6cm)。
 
 
三、实验步骤
1、使用Pipetty电动移液器移取适量待检血清至离心管中，置于56℃水浴锅灭活30 min，灭活后分装置于-20℃保存，避免反复冻融。
2、用Pipetty移取盐水/HEPES缓冲液，洗涤绵羊红细胞，至少洗涤3次：第1次1500 r/min，离心5 min；第2次、第3次洗涤后，1500 r/min，离心10 min。洗涤完成后，移取适量盐水/HEPES缓冲液，配制8%绵羊红细胞悬液，轻轻振荡混匀，备用。
3、用Pipetty，分别移取0.6 mL、1.2mL、1.8 mL H3N8亚型EIV病毒液，至含有2 mL 8%绵羊红细胞悬液中，分别标记为病毒液A、病毒液B、病毒液C，置于2°C~8°C冰箱中孵育10min。设不致敏红细胞，即不加病毒的红细胞作空白对照板。
 
4、用Pipetty分别移取0.3mL、0.6 mL、0.9 mL、1 mL氯化铬工作液（生理盐水1:400稀释），缓慢加入病毒液A、病毒液B、病毒液C和2mL空白对照不致敏红细胞中，每加入1管后轻轻摇动混合，置于22°C（±2°C）室温下静置5min。1500 r/min离心10 min，弃上清液。
5、用Pipetty移取适量盐水/HEPES/BSA缓冲液，轻轻混悬红细胞沉淀，再次1500 r/min离心10 min，弃上清液。2mL PBS“A”缓冲液重悬红细胞沉淀，此时红细胞浓度维持为8%。
6、使用Pipetty分别移取0.9mL病毒液A、病毒液B、病毒液C致敏的红细胞液，加入至3支含有7.8mL融化琼脂糖的试管中，迅速轻轻混合均匀，再加入0.3mL补体，轻轻混合后，立即倒入置于水平桌面上的免疫扩散平板或平皿中，不加盖，自然风干5min。
7、反应板加盖，置于湿盒中，2°C~8°C冰箱存放，制备好的反应板可保存数周。
8、按上述步骤，使用未致敏的绵羊红细胞制备空白对照板，用于排除非特异性溶血反应。在制备好的免疫扩散板上距平板边缘至少6mm处打孔，孔径3mm，孔距12mm。
9、用Pipetty分别吸取10μL阳性血清、阴性血清，缓慢加入同一致敏反应板的相应孔中，置于湿盒中，34℃恒温箱孵育20h。孵育完成后，取出反应板，用游标卡尺测量阳性血清产生的溶血圈直径，扣除孔面积，计算溶血面积。
 
10、对比病毒液A、病毒液B、病毒液C致敏红细胞制备的反应板，选择阳性血清产生溶血环最大、最清晰的反应板对应的病毒液用量，作为最佳病毒液用量，后续待检血清检测均使用该用量制备反应板。
11、将处理好的待检血清，以及阳性、阴性对照血清，用Pipetty电动移液器分别吸取10μL，加入同一个反应板加样孔中，每孔对应1份样品，做好清晰标记，置于湿盒中，34℃恒温箱孵育20h。孵育完成后，测量各孔溶血圈直径，扣除孔面积，计算溶血面积。
 
四、结果判定
1、试验成立的条件
阴性血清无溶血圈，阳性血清产生溶血环，且直径>5mm，空白对照板上血清无溶血圈。
2、阳性
出现溶血圈，判定为EIV抗体阳性。
3、阴性
无溶血圈，判定为EIV抗体阴性。