方案摘要： 本方案使用了Pipetty电动移液器的核心优势，结合实验操作流程，包括核酸提取、RT-PCR反应体系配制、扩增产物检测等关键步骤。相较于传统手动移液器，Pipetty电动移液器具备突出的连续分液优势，可实现单次吸液、多次精准分液，有效避免手动反复吸液导致的体积误差，同时降低长时间操作带来的手部疲劳，大幅提升移液效率；其精准的体积控制能力，能有效规避手动移液器因人为按压力度不均、操作手法差异造成的移液偏差，进一步提高实验重复性和检测准确性，为猪水疱病的快速、精准诊断提供标准化操作依据。
 
 
方案详情：
一、实验原理
猪水疱病（SVD）是由猪水疱病病毒（SVDV）引起的一种急性、接触性传染病，其病毒核酸为单股正链RNA。荧光RT-PCR技术结合了反转录（RT）和实时荧光定量PCR（qPCR）的优势，首先通过反转录酶将病毒RNA逆转录为互补DNA（cDNA），再以cDNA为模板，利用特异性引物和荧光探针，在Taq酶的作用下进行PCR扩增。扩增过程中，荧光探针被酶切降解，释放出荧光信号，荧光定量PCR仪实时监测荧光信号强度，通过循环阈值（Ct值）判断样本中是否含有SVDV核酸及核酸含量。Pipetty电动移液器通过精准控制移液体积，确保反转录和PCR扩增体系中各试剂比例准确，减少人为误差，保障实验结果的可靠性。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 荧光定量PCR仪；
③ 台式高速冷冻离心机；
④ 无核酸酶的离心管与吸头；
⑤ 荧光PCR扩增管或荧光PCR反应板。
 
2、试剂和材料
① 上游引I物:5'-GGCAACGCATACAGCATGTT-3'.
   下游引I物:5'-GCCGTATGTCCCTTGCTTGT-3'0
探针:5'-FAM-TATGACGGGTGGGCCAGGTT-BHQ1-3'。
       ② 荧光RT-PCR反应试剂:一步法荧光RT-PCR反应缓冲液、酶混合液(含反转录酶、Tag酶和RNase抑制剂等)。
③ 总RNA提取试剂。
 
 
三、实验步骤
1、选用酚-氯仿法、RNA提取试剂盒、自动化核酸提取仪等方式进行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步骤:
a)用Pipetty电动移液器取待检样本、阴性对照、阳性对照各300μL，分别置于1.5mL无核酸酶离心管中，每管加入300μL变性液异硫氰酸胍或Trizol试剂，反复轻轻混匀，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸钠（pH4.0），轻轻混匀；
 
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，冰浴5min；
D）8000r/min离心10min，将上清液转入另一洁净离心管;
e)加800μL异丙醇，混匀，室温放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，离心10 min,倒掉上清液，尽量倒干液体，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(体积分数)乙醇颠倒洗涤沉淀，4℃，10 000r/min,离心5min。倒干液体,室温干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty连续分液模式，每管加10μL无核酸酶水，用于溶解RNA。总RNA提取液可立即用于RT-PCR扩增，也可置于-70℃冰箱储存备用。
2、为每个样品准备荧光RT-PCR混合物，推荐为待检的批量样品整批准备扩增预混合体系为宜，并按照样本数n+2+1准备反应体系。
荧光RT-PCR检测扩增预混合体系为:
----------12.5μL 2×一步法荧光RT-PCR反应缓冲液;
----------1μL酶混合液;
----------0.5μL上游引物10 μmol/L;
----------0.5μL下游引物10 μmol/L;
----------0.5μL探针10 μmol/L;
----------7μL无核酸酶水。
 
3、根据计算的总体系量，用Pipetty电动移液器依次吸取各试剂，加入同一洁净无核酸酶离心管中，轻轻混匀，避免产生气泡。使用Pipetty的连续分液模式，将配制好的预混合体系按22μL/管的量，分装入荧光PCR扩增管中；
4、在已分装有预混合体系的PCR扩增管中，分别加入3μL已提取的总RNA，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀。放入台式离心机中，短暂离心。
 
5、将PCR扩增管放入荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行RT-PCR扩增：42℃ 30min，94℃ 3min，然后94℃ 20s、60℃ 30s，共40个循环。
6、试验成立条件
阴性对照无Ct值,并且无扩增曲线;阳性对照的Ct值应≤25,并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
 
四、结果判定
1、Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，判定样品为SVDV核酸阳性。
2、无Ct值，且无扩增曲线，则判为SVDV核酸阴性。
3、当35＜Ct值＜38，且出现特异性扩增曲线的样本应重新检测，重新检测结果无特异性扩增曲线或无Ct 值或者Ct 值＞38为SVDV核酸阴性。Ct值≤38且有特异性扩增曲线则判为SVDV核酸阳性。