Pipetty电动移液器在马流感RT-PCR实验中的应用
方案摘要：本方案结合了Pipetty电动移液器精准控量、连续移液、操作稳定、防交叉污染的核心优势，规范样品处理、RNA提取、反应体系配制等关键操作环节，规避手动移液易出现的误差、效率低下、污染风险等问题，充分发挥其移液精准度高、重复性强、操作便捷的特点，保障实验结果的准确性、一致性和可靠性，为马流感的快速、精准检测提供标准化操作依据，适用于动物疫病防控机构、兽医实验室等开展马流感核酸检测工作，助力提升检测工作的效率与质量。
 
 
 
 
方案详情：
一、实验原理
将马流感病毒（EIV）感染样品中的RNA提取后，利用一步法RT-PCR技术，通过逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，借助特异性引物（HF、HR、MF、MR）进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，通过凝胶成像系统观察特异性条带，根据条带大小及有无，判定样品中是否含有马流感病毒核酸，实现对马流感的快速检测。
 
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 低温台式高速离心机；
③ PCR仪；
④ 电泳仪；
⑤ 水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像系统。
 
2、试剂和材料
① 病毒RNA提取试剂盒；
② 一步法RT-PCR试剂盒；
③ 琼脂糖；
④ 引物；
⑤ 阳性对照:EIV鸡胚/细胞培养物、EIV核酸标准样品/质控品、感染EIV的阳性组织样品、RT-PCR阳性对照质粒均可作为阳性对照；
⑥ 阴性对照(DEPC处理水)；
⑦ 带有250bp和500bp分子质量的DNAMlarker(如:DL2000)。
 
 
三、实验步骤
1、将采集的拭子样品充分捻动、挤干后，使用Pipetty电动移液器MSIC01-03-1000移取200μL样品液，转入无菌离心管中，备用。
2、使用病毒RNA提取试剂盒，按试剂盒说明书步骤提取病毒RNA：借助Pipetty电动移液器，精准移取试剂盒中的裂解液、洗涤液等试剂，加入样品液中，充分混匀后经低温台式高速离心机离心处理；最后用移液器移取洗脱液，收集提取的病毒RNA。提取的病毒RNA应立即进行RT-PCR反应，若暂不反应，需置于-70°C冰箱保存。
3、将RT-PCR试剂盒中的所有试剂置冰上融化，充分混匀后备用；取n+2个PCR反应管（n为待检样品、阳性对照和阴性对照·数总和），将4种引物分别配制成10μmol/L的使用液。在25μL反应体系中，每种引物加1μL，按照表1所示比例，使用Pipetty连续分液模式，精准移取各试剂组分，依次加入PCR反应管中。  
4、将加样后的PCR反应管按顺序放入PCR仪中，设置如下反应程序并启动反应：42°C反转录30min，94°C预变性2min，进行1个循环；94°C变性30s、53.6°C退火40s、72°C延伸40s，进行30个循环；72°C延伸10min，反应结束后取出PCR反应管。
注：反应体系和反应条件，可根据所使用RT-PCR试剂盒的说明书，适当调整各试剂用量及反应温度和时间。

1. 配制1.5%琼脂糖凝胶，待凝胶凝固后，使用Pipetty分别移取5μL PCR产物和5μL DNA Marker，依次加入凝胶加样孔中，接通电泳仪电源，进行电泳；电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中，观察并记录扩增条带情况。

 
四、结果判定
1、结果成立条件
阳性对照扩增出596bp和224bp大小的两条片段;阴性对照没有特异性片段。
2、阳性
待检样品扩增出596bp和224 bp大小的两条片段，判定为H3亚型EIV核酸阳性。
3、阴性
待检样品无扩增产物，判定为H3亚型EIV核酸阴性。
4、疑似
待检样品仅扩增出一条224 bp片段判定为疑似EIV核酸阳性。再次RT-PCR检测后，如仍为一条224bp片段，则样品可能含有其他类型流感病毒，应进行病毒分离鉴定，或重新采样进行检测。
待检样品仅扩增出一条596 bp片段判定为疑似EIV核酸阳性。再次RT-PCR检测后,如仍为一条596bp片段，则样品可能污染，应重新采样进行检测。