抗体药物偶联物（ADC）是一类生物分子，通常由单克隆抗体（mAb）通过化学连接子与小分子药物结合而成。ADC 属于靶向治疗药物，其抗体部分可靶向结合细胞表面的抗原，将药物递送至靶点部位。尽管这类疗法目前主要用于治疗癌症，但该领域的应用范围正逐步拓展至其他疾病靶点。蛋白浓度和药物抗体比（DAR）可用于全程监控抗体药物偶联物的生产制造过程。

抗体药物偶联物的生产制造要点
切向流过滤（TFF）是生物分子纯化过程中的常用技术。该技术可通过渗透液去除小分子物质，同时截留大分子物质，并将其随截留液回流至料液体系中（见图 1）。切向流过滤主要包含两种操作模式：渗滤（DF）和超滤（UF）。渗滤可在维持料液浓度不变的前提下，通过渗透液去除小分子物质，在抗体药物偶联物生产中，渗滤技术可用于缓冲液置换、将偶联蛋白转移至新的缓冲液体系，以及去除多余的小分子物质。超滤则是对生物分子进行浓缩的工艺，缓冲液可透过滤膜，而蛋白质、偶联物等大分子物质会被截留，从而实现料液体积减小、蛋白浓度提升的效果。

图 1：切向流过滤工艺示意图

研究人员通常会设定固定的渗滤体积倍数（DV），并在指定时间点取样，以此评估游离药物的清除效果和缓冲液置换情况。但这种方式需对数据进行回顾性分析，导致实验操作与数据分析之间存在延迟。同时，该方法还可能造成时间和资源的浪费,因为实际游离药物的清除可能在设定的渗滤体积倍数完成前就已实现；反之，若设定的渗滤体积倍数无法实现游离药物的有效清除，实验则需要重新进行。因此，在工艺开发阶段，必须确定合理、可靠的渗滤体积倍数。

在超滤过程中，为达到目标药物浓度，需对蛋白浓度进行精准监控。传统操作中，研究人员通常在超滤完成后取样检测，但离线分析耗时较长，会造成工艺延迟。此外，操作人员在获得离线分析结果前，无法判断蛋白质是否透过滤膜，这可能导致样品的大量损失或进一步的工艺延误。

有一种解决方案是采用在线紫外 - 可见（UV-vis）光谱法测定蛋白质和药物浓度，前提是该药物在紫外 - 可见光谱区具有吸光特性。

但传统在线紫外 - 可见传感器的动态检测范围有限，原因在于紫外 - 可见吸光度同时取决于样品浓度和光程长度。同样，固定光程传感器在浓度较高时，一旦总吸光度超出传感器检测极限，往往就会出现信号饱和现象。

可变光程技术（VPT）是一项应用于紫外 - 可见分光光度法的专利技术，其核心是基于朗伯 - 比尔定律推导而来的斜率光谱公式。瑞普利金公司（Repligen）的 PATsmart SoloVPE Plus 和 FlowVPX 系统均采用了该技术，通过逐步减小光程并采集 5~10 个数据点绘制斜率曲线，确定最佳吸光度值，再结合用户提供的物质消光系数计算浓度。其中，在线 FlowVPX 仪器约每 10 秒完成一次检测，可实现浓度和药物抗体比的实时监控；开启模拟输出信号后，该系统可形成反馈回路，无需人工干预即可实现工艺的自动控制。

案例研究
本研究旨在实现以下目标：在渗滤和超滤过程中，监控料液管路中的蛋白浓度和药物抗体比；监控渗透液管路中的游离药物清除情况；对比 FlowVPX 系统与成熟的 SoloVPE 方法的检测数据。为达成上述目标，研究共使用两套 FlowVPX 系统 —— 一套安装在料液管路，用于监控药物抗体比和抗体药物偶联物浓度；另一套安装在渗透液管路，用于追踪药物清除过程。

材料与方法03研究同时对两套配备 3mm 一次性流通池的 FlowVPX 系统和一套 SoloVPE 系统进行了测试。本研究未启用 FlowVPX 系统的模拟信号功能，所有实验数据均通过 CTech ViPER ANLYTX 软件记录。

实验所用抗体药物偶联物由单克隆抗体、药物及市售连接子偶联而成，初始浓度为 5 mg/mL，药物抗体比为 4。为模拟偶联反应后体系中常见的游离药物水平，研究人员向该抗体药物偶联物溶液中加入 1.1 mM 药物溶液，使体系中游离药物当量达到 3.2，以便监控游离药物的清除过程。渗滤过程中，研究人员通过控制向料液中添加缓冲液的量来调节蛋白浓度，同时利用 FlowVPX 系统对蛋白浓度进行实时监控。实验装置见图 2。

图 2：实验装置示意图（TFF = 切向流过滤，VPX=FlowVPX 系统）

蛋白浓度可通过对朗伯 - 比尔定律公式（公式 1：A=ε×C×l）变形推导得出（公式 2：c=A÷(ε×l)），其中，A为吸光度，ε为摩尔消光系数，c为浓度，l为光程。若考虑稀释倍数（DF），则计算公式为公式 3：C=(A×DF)÷(ε×l)。

药物抗体比的计算需通过联立方程分别得出药物（cdrug）和蛋白质（cmAb）的摩尔浓度，其中λ(drug)为药物 - 连接子的特征吸收波长，计算公式如下：

公式 4：
cmAb=(A280εdrugλ(drug)−Aλ(drug)εdrug280)÷[(εmAb280εdrugλ(drug)−εmabλ(drug)εdrug280)×l]

公式 5：
cdrug=(A280εmabλ(drug)−Aλ(drug)εmab280)÷[(εdrug280εmAbλ(drug)−εdrugλ(drug)εmAb280)×l]

药物抗体比的计算公式为公式 6：DAR=cdrug÷cmAb。

斜率光谱技术对朗伯 - 比尔定律进行了改进，将光程项（l）移至公式左侧，得到公式 7：A÷l=ε×C。

吸光度与光程数据经回归分析得到线性方程（公式 8：A=m×l+b），其中m为回归直线的斜率，b为线性方程的纵截距。回归方程中斜率项的单位为吸光度 / 光程，即吸光度 / 毫米（Abs/mm），因此可直接将公式 7 中的A÷l替换为公式 8 中的斜率项m，进而得到斜率光谱公式（公式 9：m=ε×c）。

FlowVPX 系统采集的吸光度 - 光程数据经线性回归分析后，可通过公式 9 计算样品浓度，且软件会将每次的浓度检测结果绘制成图，实现浓度的实时监控。

除斜率值外，FlowVPX 系统的线性回归分析还会给出决定系数（R2），该参数可反映检测数据的线性程度，验证其是否符合朗伯 - 比尔定律，是 FlowVPX 系统所有检测结果的实时内置质量验证指标。本研究中 SoloVPE 系统的检测参数与 FlowVPX 系统保持一致，且所有样品均进行三次平行检测。

结果与讨论
药物清除：研究人员将 5 mg/mL 的抗体药物偶联物溶液加入料液储罐并进行循环，耗时约 40 分钟，完成蛋白浓度和游离药物的基线校准。随后向体系中加入 1.1 mM 游离药物（3.2 当量），模拟偶联反应后的游离药物水平，使体系的药物抗体比从 4 提升至 7。料液管路的 FlowVPX 系统可监控到抗体药物偶联物浓度的变化和药物抗体比的升高，而渗透液管路的 FlowVPX 系统则可检测到添加的游离药物开始进入渗透液的时间点。随着渗透液管路的紫外 - 可见吸光度下降，研究人员可实现对游离药物清除过程的监控。

图 3 为渗透液管路（上）和料液管路（下）在两个特征波长下的吸光度检测数据，其中红线代表游离药物浓度，绿线代表抗体药物偶联物浓度。结果显示，加入游离药物约 15 分钟后，渗透液中开始检测到药物，约 130 分钟后药物浓度达到峰值；在随后的 100~150 分钟内（约 2 个渗滤体积倍数），药物吸光度持续下降，表明游离药物正在被清除，红线与横轴之间的面积代表被清除的药物总量。研究发现，2 个渗滤体积倍数可清除约 70% 的游离药物，且随着体系中游离药物浓度降低，清除速率会逐渐减慢，通常需 8~10 个渗滤体积倍数才能实现游离药物的完全清除。

图 3：ViPER 软件绘制的渗透液和料液管路检测数据图（红线为游离药物浓度，绿线为抗体药物偶联物浓度；DV = 渗滤体积倍数）

料液管路中游离药物的添加在 50 分钟前完成，表现为药物吸光度的急剧上升。在整个渗滤过程中，由于游离药物被不断清除，抗体药物偶联物与药物的斜率差值逐渐增大。图 4 为药物抗体比随检测周期数的变化曲线（1 个检测周期对应 1 次浓度检测），结果显示，加入游离药物后，药物抗体比从 4 提升至 7，2 个渗滤体积倍数后，体系最终药物抗体比为 4.8。

图 4：药物抗体比随检测周期数的变化曲线

渗滤过程中，研究人员通过在料液储罐上标记刻度线，控制缓冲液的添加量以维持料液体积稳定，进而实现蛋白浓度的控制。研究人员在指定时间点从储罐中取样，采用已建立的 SoloVPE 方法检测，将所得数据与 FlowVPX 系统的检测数据进行对比，结果见表 1。两套系统检测结果的一致性通过公式 10 计算：Agreement = (FlowVPX data ÷ SoloVPE data) × 100%

表 1：FlowVPX 与 SoloVPE 系统的蛋白浓度检测数据（DF = 渗滤，DV = 渗滤体积倍数，eq = 当量）

抗体药物偶联物浓度：在另一组实验中，研究人员评估了 FlowVPX 系统监控蛋白浓度的能力,向储罐中加入定量的抗体药物偶联物，随后依次进行浓缩和稀释操作；每次浓缩操作均通过打开渗透液管路、关闭缓冲液进料泵实现。表 2 为浓缩和稀释操作的步骤概述，料液管路的 FlowVPX 系统对每一步操作进行全程监控；由于料液体积较小，研究人员从截留液管路取样，采用 SoloVPE 系统检测并与 FlowVPX 系统的结果对比，蛋白浓度的检测值和理论值见表 3。图 5 为 FlowVPX 系统在浓缩和稀释过程中的实时检测数据。

表 2：超滤操作步骤

表 3：FlowVPX 与 SoloVPE 系统的超滤检测数据

图 5：FlowVPX 系统在浓缩和稀释过程中的实时检测数据（红线为游离药物浓度，绿线为抗体药物偶联物浓度）

蛋白浓度的理论值需在已知料液体积的前提下才能准确计算，浓度（c）与体积（v）的关系遵循公式 11：c1×v1=c2×v2。

研究人员计算了 UF1、UF2 和 UF6 样品的蛋白浓度理论值，其中 UF6 样品因操作误差被过度浓缩 5%，这也是 FlowVPX 系统的检测值略高于理论值的原因。检测值与理论值之间的偏差还可能与流速过慢有关，此外，取样时料液体系若未完全混匀，也会造成检测偏差。

FlowVPX 系统的检测值与 SoloVPE 系统的检测值比值多在 90%~110% 之间，表明两套系统的检测结果具有良好的一致性。低流速会影响浓缩样品的混匀效果，因此取样时样品可能未完全混匀。FlowVPX 系统的检测数据（图 5）与浓度的预期变化趋势一致：切向流过滤过程中蛋白浓度缓慢变化，加入缓冲液稀释时蛋白浓度则急剧下降。

结论
本研究表明，FlowVPX 系统可作为抗体药物偶联物工艺开发和生产制造中的实用工具：该系统可实现游离药物清除的实时监控，在开发稳定的切向流过滤工艺时，能有效缩短整体工艺时间，降低成本。

FlowVPX 系统可对关键工艺参数进行实时监控，大幅缩短数据反馈和工艺验证的时间，助力生产团队及时做出科学的决策；在线检测无需大量的离线分析操作，也简化了稳定工艺向生产环境的转移过程，同时还提升了渗滤过程中的料液体积控制精度。此外，该系统还能降低长时切向流过滤操作的监控复杂度，缩短工艺周期。

FlowVPX 系统可对切向流过滤过程中的药物抗体比和单克隆抗体浓度进行持续监控，助力研究人员全面理解工艺过程；该系统对工艺条件的及时反馈，有助于快速排查工艺问题，实现超滤和渗滤工艺的有效优化。本研究中，研究人员通过 FlowVPX 系统监控药物清除过程，确定了去除杂质分子的最佳渗滤体积倍数。在大规模生产中，持续的工艺监控能及时发现渗漏、膜污染等问题。

总体而言，在抗体药物偶联物生产中引入 FlowVPX 系统，可实现样品的高效管理，降低操作和耗材成本，加快数据反馈和分析速度，同时对产品质量进行全程监控。