本研究聚焦突触活性区核心支架蛋白RIM1的液液相分离机制，通过在活细胞中开展系统的截短突变与功能验证实验，解析了RIM1不同结构域及序列元件对相分离凝析物形成的贡献，揭示了蛋白片段长度与相分离富集程度的指数关联规律，同时阐明了结合蛋白RIM-BP2在不同表达水平下对RIM1相分离的差异化调控作用，为理解突触活性区的分子组装机制提供了活细胞层面的实验依据。

该研究由 Luis Kersten、Maksim Galkov、Paulina Nemcova 等学者完成，通讯作者为 Dirk Dietrich 与 Susanne Schoch，论文题为《Dissecting the propensity ofRIM1subdomains to form phase condensates》，于2026年6月在线发表于 Nature 旗下期刊 Scientific Reports。

重要发现
01活细胞荧光成像体系下RIM1相分离的液态特性验证
研究首先在人胚肾细胞中过表达带荧光标签的全长RIM1蛋白，通过活细胞单平面共聚焦成像观测，发现转染24 小时后细胞核质内出现明显的球状凝析样结构。为排除荧光标签对相分离行为的干扰，研究分别采用GFP与Flag两种不同标签标记RIM1，经免疫荧光成像与定量分析证实，两种标签的RIM1均能形成凝析物，且液滴数量与尺寸的定量结果无本质差异，说明凝析物形成完全由RIM1自身序列决定，与标签种类无关。针对液滴定位于细胞核的现象，研究通过DNA荧光染料对活细胞进行染色后共成像，确认RIM1凝析物与核内DNA结构无空间重叠，排除了DNA结合介导聚集的可能。

单平面共聚焦代表性图像

为进一步验证凝析物的液液相分离属性，研究引入光激活荧光蛋白标记RIM1，结合定点光激活与高时间分辨率序列成像技术，对液滴内分子的动态特性进行观测。实验中对单个液滴内的局部区域进行光激活，随后连续采集荧光信号的时空变化，结果显示被激活的荧光分子可在数秒内均匀扩散至整个液滴内部，但始终被限制在液滴边界内；与之相对，核质中游离的激活荧光蛋白会快速弥散且无空间边界限制。这一结果直接证明RIM1凝析物内部的分子具有流动性，同时与周围溶液存在动态平衡，符合液液相分离形成的生物分子凝析物的典型液态特征。研究同时在原代海马神经元中验证了RIM1的相分离能力，发现其在神经元胞体的细胞核与细胞质中均可形成凝析物，且液滴尺寸显著大于异源细胞系中的观测结果。

全细胞光激活后活HEK293T细胞的单平面图像

原代海马神经元的代表性单平面共聚焦图像

定量结果显示，全长RIM1的相分离倾向最高，所有截短突变体中，仅缺少内在无序区的结构化片段以及仅含单个脯氨酸富集基序与IDR2的片段无法形成可观测凝析物，其余片段即使长度短至约250个氨基酸，仍能在细胞内形成凝析样组装体。对所有有效突变体的分析表明，除4个特殊片段外，蛋白在液滴中的富集程度随片段长度增加呈指数增长，即荧光强度比的对数与氨基酸数量呈线性相关。研究进一步发现，包含N端锌指结构域至C2A结构域的截短体，其液滴数量与体积的细胞分布特征可高度重现全长RIM1的性质；而由PDZ结构域、C2A结构域、IDR2、PRM2 及任意一个额外脯氨酸富集基序组成的区域，可复现全长蛋白的液滴体积分布规律。实验同时证实，内在无序区是RIM1发生相分离的必要元件，仅含结构化结构域而无内在无序区的片段完全不具备相分离能力；不同脯氨酸富集基序对相分离的贡献存在差异，其中PRM2与PRM3的功能缺失对全长蛋白的液滴形成仅产生微弱影响。

单平面共聚焦图像

研究进一步测试了RIM-BP2对不同RIM1截短体的调控作用，发现其效应具有明显的序列依赖性。对于包含PRM2与PRM3的截短片段，RIM-BP2可显著提升其相分离能力，增大液滴体积；对于原本无法自主形成液滴的PRM2-IDR2片段，RIM-BP2的结合可直接诱导其发生相分离。与之相反，对于包含PRM1的截短片段，RIM-BP2不仅没有促进作用，反而会抑制其相分离能力。这种差异化调控效应表明，细胞内相分离行为并非由单一互作决定，而是受到多价互作网络的综合调控，且细胞环境下的调控规律与体外纯化体系存在显著差异。

RIM1向细胞核的易位由核定位信号介导

研究还解析了RIM1凝析物定位于细胞核的分子机制，通过生物信息学预测结合截短验证，在RIM1的C端区域鉴定出两个功能性核定位信号。实验证实，单个核定位信号即可介导RIM1片段的核输入，当两个信号同时缺失时，相应片段的凝析物完全分布于细胞质中，说明RIM1的相分离能力不依赖于亚细胞定位。

创新与亮点
本研究突破了体外纯化体系无法还原细胞内复杂环境的局限，建立了基于活细胞荧光成像的相分离定量分析体系，解决了细胞内相分离倾向难以精准、高通量评估的技术难题。研究将定点光激活荧光示踪技术与时间序列成像结合，在活细胞内直接验证了凝析物的液态动态属性，为相分离的细胞内鉴定提供了标准化的成像判定方法。同时，研究建立的荧光强度比定量策略，可通过常规共聚焦成像实现大量蛋白突变体的相分离能力快速筛选，大幅提升了序列功能解析的效率。该技术体系可推广至各类突触蛋白的相分离研究，为解析神经活性区的分子组装机制提供了可视化定量工具，也为神经退行性疾病中蛋白相分离异常的机制研究与干预靶点筛选提供了技术支撑。

总结与展望
本研究系统解析了突触活性区蛋白RIM1各亚结构域的相分离特性，揭示了蛋白序列长度与相分离富集程度的指数关联规律，阐明了细胞环境下RIM-BP2对RIM1相分离的浓度依赖性与序列特异性调控效应。未来可进一步在神经元突触原位验证RIM1相分离的生理功能，探索翻译后修饰与神经元活动对相分离的调控作用，为深入理解突触可塑性与神经信号传递的分子机制提供新的研究方向。

doi: https://doi.org/10.1038/s41598-026-56567-6