冻干保护剂在蛋白冻干过程中的热力学和动力学机制解析
2026-09-08 来源:本站 点击次数:19冻干保护剂——蛋白冻干过程中的热力学和动力学
概要
蛋白质类药物因为其专一性，低脱靶率和高回报，已经成为药物家族中最蓬勃发展的一个大类。但作为生物大分子，蛋白质的有效性和安全性通常取决于其高级结构的保持，而其结构的稳定性问题却常常给成药，以及后续生产，临床使用等带来显著的风险。
冻干作为最有效的保存方式，为众多不稳定蛋白的保存，提供了极大的便利。但蛋白质的高级结构在很大程度上依赖于疏水相互作用，冻干过程中低温和脱水常常造成蛋白质结构的损失。因此在冻干中使用冻干保护剂，常有效的保持了在冻干压力下蛋白的结构。解释冻干保护剂的机制的学说，最主要有氢键代替学说（hydrogen bond substitutes hypothesis）和玻璃化学说（vitreous hypothesis）。
本文主要从蛋白质物理学的角度，来介绍这两个学说。
1
蛋白质折叠过程中的温度事件
蛋白质的结构与温度有关，有热变性和冷变性现象。这些现象的发生，都取决于蛋白/蛋白，蛋白/溶剂，溶剂/溶剂这三组关系之间的平衡。
作为蛋白质溶剂的水，处于凝聚态（condensed status），也就是说，蛋白质要在其中发生任何构象的改变，无论是扩散（在统计物理学中，也常称为translation），构象改变（conformational dynamic或folding/unfolding）还是旋转（rotation或β-relaxation）都需要推动一定数量的水分子或者说受到水的结构的限制。
先假设一个较小蛋白处于解折叠状态，并分散于极度过冷的液态水中。在这一温度下蛋白质是否发生折叠，我们可以借由高分子物理学中的平均场理论来理解。当一条高分子链进入溶剂中，存在链与链的相互作用，链与溶剂的相互作用，溶剂与溶剂的相互作用。当链与溶剂的相互作用站主导地位时，则链可以很好的分散在溶剂中，并表现出自由链的性质（链随机游走）；当链与链的相互作用或溶剂与溶剂的相互作用站主导地位时，则由链内或溶剂分子间的preferential interaction，使高分子链发生结构的塌缩形成有一定固定结构的状态，从而让整个体系的焓最优化。
在蛋白质和水的体系中，采用相对简化模型，存在着3种类型的强相互作用。其中最重要的是水分子与水分子的相互作用，然后是极性氨基酸与水的相互作用以及肽链内部氢键，除此外还存在着弱相互作用，非极性氨基酸与非极性氨基酸的相互作用。
通常而言，具有高级结构的蛋白质（区别于intrinsic disorder protein），具有更多的非极性氨基酸，由于水分子更倾向于与水分子发生相互作用，这些氨基酸被迫发生迁移，发生所谓的疏水塌陷，并进一步形成肽链上的氢键这一远程有序结构。而极性氨基酸由于和水分子的相互作用则通常分布在蛋白质表面。
但需要知道的是，在这个过程中，我们忽略了熵的影响。所以回到这个较小蛋白，在极度过冷的液态水中处于解折叠的状态。如果这个较小蛋白要发生折叠，其肽链务必需要推动旁边的水分子。但由于极低温度，肽链和水分子的动能都非常小，所以这一运动实际上难以发生，所以蛋白依然处于解折叠状态，用物理化学的语言来说，就是焓减无法弥补熵减，蛋白发生折叠是一个自由能上升的过程。而随着温度的上升，蛋白和水分子的动能都大大提高，肽链可以自由移动，焓减足以弥补体系熵减。蛋白质在几种相互作用下发生折叠，而这一温度，在蛋白物理中称为冷变性温度，在高分子物理中称为lowest critical soluble concentration，高于这一温度，蛋白质处于高度有序即折叠状态。由于本文的重点在低温条件下，所以热变性部分从略。
2
保护剂：蛋白质的扩散和构象变化
在一个折叠的蛋白中，内部存在远程氢键，范德华力，外部存在极性氨基酸与水之间的氢键。当两个极性氨基酸在空间上距离足够近时，则两个极性氨基酸可以和同一个水分子形成氢键（统计物理学意义熵的同一个水分子），从而在构象上形成进一步的约束。而对于整个体系而言则分为两个相，一个是蛋白的非极性相，一个是水的极性相（需要特别说明的是，由于水的强烈的形成氢键的倾向，这一结构实际上可以看作一个波动的氢键网络结构）。在这两个相接触的部分，则形成了过度的界面，即广为人知的蛋白的水合层。
回到蛋白质在凝聚态的水中，蛋白的运动都会或多或少的推动水分子或受水分子结构的限制。经过蛋白质物理学大量的研究，现在我们已经清晰的知道，这一过程可以分为两种大的类型，其中一类是蛋白在水中的扩散，而蛋白在扩散的过程中，是保持着固定的水合层，也就是说蛋白在扩散中，实际上只需要推动作为溶剂的水，而跟水合层几乎没关系。而另一个类型，则是蛋白的构象变化，无论是fast small scale fluctuation还是slow large scale unfolding，蛋白所需要改变的则是其水合层。换一种说法，则是水合层限制了蛋白构象的变化。
由于水合层是限制蛋白构象变化的重要因素，因此使蛋白质有更稳定或者说厚度更大的水合层，则蛋白质的构象便能更贴近于其自由能最低的状态。而冻干保护剂则是这么一类物质。冻干保护剂是如何达到这一作用的，归根到底还是要回到体系的两相上来。当蛋白折叠后，体系分为蛋白相和水相，水合层是一个两相过度的界面，也就是说当两相的差别越大，则水合层的厚度则会越大（以蔗糖为例，曾有研究以SAXS发现溶菌酶在纯水中水合层仅3万个水分子，而加入蔗糖后这一数量变为80万个，但由于找不到这篇文献了，所以此处无法提供更准确信息）。基于这一原因，一切能够增强水的结构，理论上都可以通过优化蛋白的水合层，从而达到让蛋白结构更稳定的作用，这一类物质一般称为kosmotropes，通常他们都具有很强的电荷或强极性，或者说电性与极性与分子半径的比大于水的极性与其半径的关系，也正因为它们通常电学性质更优（此处将一切相互作用还原为电相互作用），它们通常更倾向于与水发生相互作用，出现我们常见的preferential exclusion的现象；而对应削弱水的结构的物质，则理论上都可以使蛋白质结构稳定性变差。但需要注意的是，在实际中，情况会更复杂，因为一种物质增强水的结构不等同于在两相中只倾向于与水发生相互作用，如果同一种物质，除了和水的相互作用外，还可能存在和蛋白的相互作用，当其与蛋白发生相互作用时，如前热力学分析中所提到的相互作用，就要增加该物质与蛋白相互作用，而当这种相互作用足够明显时，则蛋白质保持折叠的温度区间就会变得更窄，也就是说蛋白结构稳定性会变得更差。这也是为什么有的kosmotropes在另外一些蛋白上，却观察到不利的作用的原因。但需要指出的是，这不意味着kosmotropes和chaotropes需要通过特定的蛋白来界定，而只是因为相关研究者混淆了kosmotropic现象和preferential interaction现象。(参考图2所引例子)
Amy E. Rydeen, Eric M. Brustad, Gary J. Pielak. Osmolytes and protein-protein interactions. J. Am. Chem. Soc. 29 May 2018
在冻干的过程中，温度持续下降，如前所述，蛋白ΔGu也会发生下降，随着过冷的发生，冰晶的析出，蛋白不仅处于低ΔGu的状态，而且处于过浓缩状态，此文中忽略冰水界面影响。除了分子动能较小外，一切都有利于聚集的发生，因为低ΔGu意味着更高比例的蛋白处于构象松弛的状态，高浓度意味着碰撞几率的大大增加。这也是很多蛋白在冷冻过程中观察到大量损失的原因。而当蛋白质发生脱水时，如前所述，蛋白质的结构限定于水的结构，本质上来说是水的氢键网络。当水被去除时，自然这一氢键网络就会消失，在氢键网络消失后，体系就不再为凝聚态，蛋白质ΔGu发生急剧下降。使蛋白在冻干过程中进一步损失。
但是kosmotropes的加入，准确说该物质且与蛋白无相互作用或可忽略的相互作用时，由于优化了水合层，从而提高了蛋白的ΔGu，特别是在冰晶析出时，这些物质的浓度也大大提高，而对水的结构的增强也随着浓度的升高而增强，缓解甚至能够逆转蛋白质在温度降低时ΔGu下降的趋势，起到了保护蛋白的作用。而当脱水发生时，水的氢键网络虽然丧失，但是kosmotropes，如海藻糖，蔗糖，山梨醇分子间的氢键网络，代替了水的氢键网络，维持了体系的凝聚态，并限定了蛋白分子的构象的变化。这是kosmotropes对于蛋白质保护的热力学方面，也就是hydrogen bond substitutes hypothesis。
但需要注意的是，蛋白的聚集不一定晚于结构的丧失，非变形的聚集，先聚集后构象变化也常常被观察到。也就是说，蛋白只要会在溶液中运动，并发生碰撞，就有可能发生聚集。而如前所说的蛋白质的运动，除了构象的变化外，还有扩散，旋转等。其中扩散由于具有更高的能量，所以对蛋白的聚集贡献更大。
而如前所述，蛋白质的扩散，限制于溶剂水（bulk water），那改变溶剂水的性质，就有可能改变蛋白质的扩散，而kosmotropes中，糖类多元醇类物质，在较高浓度时大大的增强了水的内摩擦，从而大大提高水的粘度，进一步降低了蛋白的扩散，使蛋白彼此间碰撞的概率，在远高于glass transition的温度下，即发生显著降低（糖类作为strong glass，使体系在玻璃态和粘流态中间多了一个高弹态rubbery state，使体系在承受一定剪切时不发生流动）。这是这一类kosmotropes对于蛋白质保护的动力学方面，也就是vitreous hypothesis。
而随着温度的进一步降低，体系发生glass transition，蛋白难以推动旁边的水分子，或者冻干后的氢键网络，只能在原位发生旋转以及微小侧链的弛豫，蛋白质的稳定性被明显改善。
文章来源——冻干工艺之家公众号 • 星德科 TELSTAR 冻干工艺实验室
相关文章
更多 >