昼夜节律是内源性的“生物时钟”，调节着内分泌、代谢与免疫等生理过程以维持稳态。已有研究表明，将CAR-T细胞疗法和免疫检查点阻断等免疫治疗与免疫节律高峰期同步可提升疗效。然而，免疫治疗的获益人群仍局限于特定肿瘤类型与少数患者。因此，突破以免疫系统为核心的时辰治疗策略局限，拓展其适用范围具有重要意义。循环肿瘤来源的细胞外囊泡（Circulating tumour-derived extracellular vesicles，ctEV）在促进肿瘤转移与免疫抑制中发挥关键作用，是时辰治疗的潜在靶点。然而，其体内分泌是否受昼夜节律调控尚不明确，其核心障碍在于缺乏能够高时间分辨率解析ctEV动态变化的工具。针对这一技术空白，宋彦龄教授团队做了以下探究：

1 ctEV-CLOCK的开发
为探究循环肿瘤来源EV（ctEV）是否受昼夜节律调控，研究团队开发了ctEV-CLOCK方法，该方法通过代谢聚糖标记为为囊泡赋予“化学时间戳”，实现囊泡分泌时段区分，并结合能够靶向肿瘤标志物的核酸适体实现细胞来源区分，实现对特定12小时窗口内兼具“新生”与“肿瘤来源”双重特征的的ctEV的特异性分离。验证实验显示，经Ac4ManNAz（一种生物相容的含叠氮基团的非天然单糖）处理的小鼠乳腺癌4T1细胞来源sEV成功掺入叠氮基团，且双价适配体BiPar对EpCAM阳性sEV表现出优异亲和力（KD=2.35 nM）和快速结合动力学。进一步分析表明，该体系对同时携带叠氮标记和EpCAM的肿瘤新生EV具有高度选择性，非肿瘤EV或预先存在的EV几乎不产生背景信号。定量检测显示，ctEV-CLOCK的荧光强度与EV浓度线性相关，检测限达56.6 ng/mL总蛋白（或2.24×10⁷颗粒/mL），且最早可在代谢标记后2小时检出新生EV，其产量与超速离心法相当。以上数据表明，ctEV-CLOCK能够以12小时时间分辨率精准捕获ctEV，为后续昼夜节律分析提供了可靠工具。
 

图1. ctEV-clock的开发与验证

2 4T1乳腺肿瘤模型中ctEV的昼夜节律振荡
为探究4T1肿瘤来源ctEV的分泌是否呈现昼夜节律变化，研究团队首先优化了Ac4ManNAz的给药方式（瘤内联合腹腔注射），以实现体内新生ctEV的高效标记（图2a）。结果表明，ctEV-CLOCK系统能够特异性地捕获代谢标记且EpCAM阳性的新生ctEV，各对照组信号均极低（图2b）。进一步分析显示，在正常光暗周期下，夜间（ZT12注射）血浆中ctEV水平显著高于白天（ZT0注射），且该模式在不同肿瘤体积和皮下或原位植入部位中均保持一致（图2e,i）。为明确该振荡是否受内在昼夜节律驱动，研究团队将光照周期颠倒，ctEV的振荡模式随之反转（图2f）；在持续黑暗条件下，昼夜差异依然存在（图2h），表明该节律并非单纯由光信号引起，而是由生物钟自主维持。
 

图2. 4T1肿瘤来源的细胞外囊泡中的昼夜节律性振荡

功能实验发现，与等量白天分泌的ctEV相比，夜间分泌的ctEV显著增强4T1细胞的迁移和侵袭能力（图3d,e）。以上数据表明，4T1肿瘤来源ctEV的分泌受昼夜节律调控，且其促肿瘤功能具有时间依赖性。
 

图3. 4T1肿瘤来源的细胞外囊泡的表征与功能分析

3 4T1 ctEV蛋白质组的昼夜差异
为探究ctEV蛋白质组成是否受昼夜节律影响，研究团队利用ctEV-CLOCK分离4T1荷瘤小鼠白天和夜间12小时窗口内分泌的ctEV，并进行定量蛋白质组学分析。结果表明，共鉴定出超过1,400种蛋白质，其中夜间分泌的ctEV中有23种蛋白显著上调、30种下调；上调蛋白显著富集于血管生成、细胞外基质重塑及凝血正调控等促肿瘤通路（图4a,b）。进一步分析发现，乙酰肝素酶（HPSE）作为关键上调蛋白之一，其昼夜节律变化得到独立验证：夜间ctEV中HPSE水平明显高于白天，且该差异主要来源于HPSE阳性ctEV颗粒数量的增加，而非单个囊泡上HPSE表达强度的显著改变（图4c）。以上数据表明，ctEV的蛋白质载荷具有昼夜节律性，其中HPSE等促肿瘤蛋白在夜间的富集为时间依赖性靶向治疗提供了潜在的分子基础。

图4. ctEV蛋白质组在不同时间点的差异性及ctEVs在4T1荷瘤小鼠中的时序性靶向治疗
 

4 HPSE抑制剂在4T1荷瘤模型中疗效的时间依赖性
为探究HPSE抑制剂OGT2115的疗效是否受给药时间影响，研究团队在4T1荷瘤小鼠模型中分别于白天（ZT1）和夜间（ZT13）给予OGT2115治疗。分子对接分析证实OGT2115可结合HPSE活性位点（图4e）。结果显示，与ZT1组相比，ZT13给药显著抑制肿瘤生长，肿瘤组织坏死增加、凋亡增强，且微血管结构明显破碎（图4g-m）。为明确该时间依赖性疗效是否由肿瘤来源sEV介导，研究团队使用GW4869抑制sEV分泌，结果发现ZT1与ZT13组间的肿瘤大小和血管完整性差异均被消除（图4n-p）。进一步在Rab27a-KO 4T1荷瘤小鼠中验证，昼夜治疗差异同样消失（图5a-e）。同时，肿瘤组织HPSE表达水平及OGT2115的药代动力学特征在白天和夜间并无显著差异（图5f-j）。以上数据表明，OGT2115的疗效时间依赖性并非源于靶点表达或药物暴露的昼夜变化，而是由肿瘤来源sEV所介导，提示靶向sEV的时间疗法具有优化HPSE抑制剂治疗效果的潜力。

图5. 肿瘤来源的sEV介导了HPSE抑制剂疗效的昼夜节律性调节

5 B16-F10黑色素瘤模型中ctEV的昼夜节律振荡
为探究ctEV昼夜节律振荡在不同肿瘤类型中的普适性，研究团队在结直肠癌（CT26）、黑色素瘤（B16-F10）及黑色素瘤患者来源异种移植（PDX）模型中利用ctEV-CLOCK检测ctEV的节律性分泌。结果显示，上述模型中ctEV均在夜间呈现高分泌水平，与4T1模型一致（图6a,b）。进一步聚焦B16-F10模型，研究团队验证了ctEV-CLOCK在该体系中的选择性和灵敏度，并发现血浆ctEV丰度夜间约为白天的4倍。分离的ctEV具有典型囊泡形态，表达EV标志物及肿瘤相关蛋白EpCAM和PD-L1（图6c,d）。功能实验表明，与等量白天ctEV相比，夜间ctEV显著增强B16-F10细胞的迁移和侵袭能力，并在体内促进肿瘤生长（图6e,f）。为明确该节律是否由宿主生物钟驱动，研究团队在Bmal1敲除小鼠（Bmal1-KO）荷瘤鼠（B16-F10）中，发现ctEV分泌几乎被消除，昼夜振荡消失；而将Bmal1-KO B16-F10细胞植入野生型小鼠后，仍可观察到明显的ctEV昼夜节律（图6g,h）。以上数据表明，ctEV分泌的昼夜节律在不同肿瘤类型中保守，且该节律主要受宿主生物钟调控，而非肿瘤细胞自身的生物钟。
 

图6. B16-F10肿瘤来源的细胞外囊泡中的昼夜节律性振荡

6 抗CD47治疗在B16-F10黑色素瘤肿瘤模型中疗效的时间依赖性
为探究抗CD47免疫治疗的疗效是否受给药时间调控，研究团队首先对B16-F10荷瘤小鼠白天和夜间分泌的ctEV进行蛋白质组学分析。结果显示，夜间ctEV中CD47等促肿瘤标志物显著上调，且富集于细胞粘附、血管生成和细胞迁移等通路（图7a,b）。使用ctEV-CLOCK结合抗CD47抗体检测进一步证实，夜间ctEV上CD47水平明显高于白天，主要源于CD47阳性ctEV颗粒数量的增加（图7c）。基于此，研究团队在ZT1（白天）和ZT13（夜间）给予抗CD47抗体治疗，结果发现夜间治疗显著抑制肿瘤生长，肿瘤坏死增加、CD8+ T细胞浸润增强，且血浆TNF和IFNγ水平升高（图7d-j）。为明确该时间依赖性疗效是否由宿主生物钟驱动，研究团队在Bmal1-KO荷瘤小鼠中进行相同治疗，昼夜疗效差异被完全消除（图7k）。
 

图7. ctEV蛋白质组在一天中不同时段的变化规律及基于B16F10荷瘤模型的ctEVs时序性治疗策略的开发

进一步使用GW4869抑制sEV分泌或在Rab27a-KO B16-F10荷瘤小鼠中治疗，均发现时间依赖性疗效及CD8+ T细胞浸润差异消失（图7l-o；图8a-e）。同时，肿瘤组织CD47表达水平及抗CD47抗体的药代动力学在白天和夜间并无显著差异（图8f-h）。以上数据表明，抗CD47抗体治疗的时间依赖性疗效并非源于靶点表达或药物暴露的昼夜变化，而是由肿瘤来源sEV所介导，提示靶向sEV的时间策略有望优化免疫检查点抑制剂的治疗效果。
 

图8. 肿瘤来源的sEV介导抗CD47抗体疗效的昼夜节律性调控

总的来说，该研究打破传统时辰治疗以免疫细胞为中心的局限，通过揭示肿瘤细胞外囊泡自身的昼夜节律调控机制，实现了从“被动跟随免疫节律”到“主动靶向肿瘤囊泡节律”的治疗范式突破，为开发更广泛、更有效的、基于时间的精准治疗策略开辟了新道路。

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