单细胞数据结果提供了不同细胞类型之间的差异表达基因，这些基因参与的生物学通路决定了不同细胞类型的生物功能。因此，针对不同细胞类型的特有基因进行富集分析，可以更好的了解每种细胞类型参与的独特生物学功能，揭示和理解生物学过程中的关键分子机制。富集分析工具有GO、KEGG、GSEA和GSVA等，其中GSEA和GSVA是单细胞文章中常见的富集分析工具。

GSEA富集分析需要预先进行样本之间的组间对比分析，通常用于Case/Control的实验设计，可以获取某个通路的基因集在实验组和对照组中的上调或下调趋势。单细胞GSEA富集分析可以对不同比较组之间相同的细胞类型进行分析，也可以对不同的细胞类型进行分析。百篇文献中出现了15次结果，结果图如下。

这是GSEA分析中经典结果图的变形，X轴是实验中的所有基因，每个黑条是该基因集中的基因，我们可以知道基因在排序列表中的位置。如果基因集位于预先排列的基因列表的顶部，则通过某种度量计算出富集分数（Enrichment Score，ES），ES为正。如果基因集位于预先排列的基因列表的底部，则ES为负。

复现结果如下：

第一部分：最顶部的折线为某条通路的基因Enrichment Score的折线图。纵轴为对应的Running ES, 在折线图中有个峰值，该峰值就是这个基因集的Enrichemnt Score，峰值之前的基因就是该基因集下的核心基因。横轴代表此基因集下的每个基因，对应第二部分类似条形码的竖线。

第二部分：类似条形码的部分，为Hits，每条竖线对应该基因集下的一个基因。

第三部分：为所有基因的rank值分布图，纵坐标为ranked list metric，即该基因排序量的值，可理解为“公式化处理后的foldchange值”。

我们可以根据项目需要选择展示这三个部分结果，或者我们分别展示单个样本富集结果，示例结果如下：

在GSEA分析后除了经典结果图的展示，我们还可以用气泡图的方法展示geneset被激活还是抑制。上、下调的 GO term /pathway分开展示：

除此之外，我们还可以绘制山峦图，展示每个geneset的基因logFC分布。

基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA），是一种非参数并且无监督的分析方法。对每个样本或单个细胞按基因的表达量进行单独排序，然后将富集分数的值做标准化。通过将基因表达矩阵数据转换为基因集表达矩阵数据，从而对每个样本/细胞群的通路富集进行分析。分析流程如下，左侧输入基因表达矩阵和基因集数据库，中间是GSVA算法原理，右侧是输出的基因集变异分数矩阵。基因集变异分数可以理解为基因集内所有基因的综合表达值。

文献中经常出现的展示结果如下：

复现结果如下：

纵坐标为cluster，横坐标为通路名称。红色代表着这个通路在该细胞类型中激活，蓝色代表着这个通路在该细胞类型中是抑制的。

我们还可以在GSVA分析的结果上，进行差异比较分析,展示形式是差异基因集柱状图。两个cluster/cell type/group中具有显著差异通路的富集程度；矩形越长代表富集程度越大；GSVA score值大于0代表上调的通路，小于0代表下调的通路。

GSEA和GSVA都是基于对基因的某一个值的排序来进行富集分析。而GSEA主要是用case和control之间的差异倍数或信噪比来进行排序，GSVA则不需要做对比，而是对每个样本或单个细胞按基因的表达量进行单独排序，然后将富集分数的值做个标准化。

以上是我这次关于单细胞转录组中富集分析方法的分享。