创新组织透明技术在无标记脑成像的应用
2025-03-06 来源:本站 点击次数:491科学家一直期望在不破坏组织的前提下看清大脑内部结构，光学成像技术是重要手段，但大脑中的脂质和细胞外基质会强烈散射光线，使获取高分辨率厚组织图像困难重重。在这种情况下，基于FxClear的组织透明化技术为大脑成像带来希望，有望突破现有困境，帮助我们更清晰地认识大脑，开启探索大脑奥秘的新篇章。
研究背景与技术挑战
厚组织成像的“绊脚石”
在光学显微镜下对厚组织进行高分辨率成像一直是个难题。大脑组织的复杂性是成像的一大障碍，其中的脂质和细胞外基质是“罪魁祸首”。脂质在大脑中广泛存在，特别是在白质区域，其富含的髓鞘脂质使得光线散射严重。
为了克服这些困难，组织透明化技术应运而生。通过各种方法减少光线散射，让大脑变得“透明”起来，以便更好地观察内部结构。目前已有多种组织透明化技术，大多数是基于物理策略来降低光线散射。比如，通过去除脂质这一主要的光线散射源，然后将组织浸泡在折射率匹配介质中，减少组织成分的不均匀性。然而，这些技术并非十全十美。
不同组织对这些技术的反应各不相同，以大脑的灰质和白质为例，由于白质含有丰富的脂质髓鞘，其组织透明化效率与灰质存在差异。而且，组织的大分子含量和排列具有独特性，这使得其光学性质因组织类型和状态而异，这些因素对组织透明化效果的影响程度也不尽相同。研究表明，在大多数组织中，折射率匹配对组织透明化效果的影响最大，这意味着组织细胞外基质的性质可能是影响组织清晰度的关键因素。但现有技术在处理不同组织时，很难精准地平衡各种因素，以达到理想的透明化效果。
标记成像的困境与无标记成像的需求在脑成像研究中，免疫染色的体积成像虽然在许多实验中取得了成功，但获得均匀染色的厚样本却并非易事，而且染色过程可能会对组织的原有结构和功能产生影响。因此，无标记成像技术的需求日益迫切，可以在不引入外部标记的情况下，直接观察组织的结构和变化，避免了标记带来的潜在干扰。基于折射率差异的无标记成像技术具有很大的潜力，光学相干断层扫描（OCT）就是其中一种重要的成像技术，能够识别生物组织的固有散射特性，广泛应用于正常和病理组织结构的无标记检测。然而，OCT系统价格昂贵，并非所有实验室都能配备，而且利用传统光学显微镜进行厚组织的无标记成像研究相对较少，这也为该领域的发展带来了挑战。
技术创新与应用
FxClear技术的核心“武器”
FxClear技术是本研究的核心，主要通过洗涤剂对组织进行脱脂处理。与其他脱脂方法不同的是，FxClear技术不会将脂质完全去除，而是保留了一定比例的脂质，这一特点反而成为了它的优势。在大脑组织中，这种不完全脱脂使得白质和灰质之间的对比度增加，巧妙地加深了某些区域的颜色，让画面的层次更加分明。
研究人员发现，不同的折射率匹配介质对组织成像有着显著影响。他们选择了果糖和碘克沙醇等化合物作为折射率匹配介质，这些化合物具有高水溶性和合适的折射率范围。实验结果显示，当调整匹配溶液的折射率时，ACT和FxClear技术处理的样本中，灰质和白质的透明度对比度会发生变化。在FxClear技术处理的样本中，灰质和白质的透明度受折射率值的影响更为明显，且灰质与白质的透明度比值更大。
进一步研究不同的折射率匹配试剂发现，即使调整所有介质的折射率相同，由于脱脂程度和介质种类的不同，样本的透明度也会有显著差异。其中，碘克沙醇表现出最高的灰质与白质比值，能够为小鼠脑1mm连续切片的神经束可视化提供足够的对比度，在透射光显微镜或立体显微镜下都能清晰观察到神经束。
不同脱脂方法的“大比拼”
为了验证其他脱脂方法是否适用于无标记成像，研究人员选择了CUBIC和iDISCO这两种常用的组织透明化方法。实验结果表明，CUBIC和iDISCO处理的脑切片虽然具有较高的组织透明度和灰质与白质对比度，但CUBIC处理的切片对比度明显不如FxClear技术或iDISCO处理的切片。这说明不同的脱脂方法各有优劣，FxClear技术在提供高折射率对比度方面具有独特的优势，能够为标记成像提供更好的基础。
FxClear技术在病理研究中展现出了强大的能力。研究人员利用该技术对创伤性脑损伤（TBI）、阿尔茨海默病（AD）等病理模型进行研究。结果发现，优化后的FxClear能够在TBI后3天就敏感地识别出损伤区域。对于AD模型，研究人员发现该技术能够清晰地显示出AD小鼠脑中的淀粉样β（Aβ）斑块。在透射光成像中，刚果红标记的Aβ斑块区域呈现出暗斑，与周围组织区分开来。这表明FxClear技术能够有效地识别病理特征，为相关疾病的研究和诊断提供了有力的工具。
成像实验与结果分析
光学成像“工具包”大显身手
为了全面评估FxClear技术的成像效果，研究人员使用了多种光学成像技术，包括传统的透射光显微镜、立体显微镜，以及先进的光学相干断层扫描（OCT）和光学相干显微镜（OCM），还有基于自发荧光的选择性平面照明显微镜（SPIM）。
传统显微镜下的“新发现”
在传统的透射光显微镜和立体显微镜下，FxClear处理的样本展现出独特的成像效果。通过调整折射率匹配介质，研究人员能够清晰地观察到小鼠脑切片中灰质和白质的差异，以及神经束的分布。在高对比度的成像下，神经纤维束的走向和结构一目了然，不同的折射率匹配介质能够突出不同的组织特征，为研究人员提供了更多观察和分析的角度。
OCT和OCM技术为研究人员提供了更深入的信息。在OCT图像中，经过折射率匹配的脑切片，灰质和白质的对比度比未匹配的切片更加明显。通过测量光的穿透深度和对比度发现，FxClear处理结合折射率匹配能够显著提高成像深度和质量。OCM成像则能够更清晰地显示样本中的纤维束结构，OCM成像呈现出最清晰、对比度最高的纤维束图像。
SPIM的“立体呈现”
基于自发荧光的SPIM技术为研究人员带来了全新的视角。使用自制的SPIM系统，研究人员成功对FxClear处理的整个半脑切片小鼠脑进行成像。在高分辨率成像下，小脑、海马体和胼胝体中的纤维投射结构以及大脑皮层中的血管都清晰可见，发现一些在之前基于折射率成像中不太明显的特征，为大脑结构的研究提供了更全面的信息。
成像结果的“量化分析”
为了更准确地评估成像效果，研究人员对各项指标进行了量化分析。在组织透明度方面，通过测量不同处理样本的透明度，发现不同的脱脂方法和折射率匹配介质对组织透明度有显著影响。例如，在比较FxClear、CUBIC和iDISCO处理的样本时，发现它们的透明度和灰质与白质的对比度存在明显差异。
在OCT成像中，对光穿透深度、对比度等指标进行量化分析，结果表明FxClear处理结合碘克沙醇折射率匹配能够提供最佳的对比度和足够的成像深度，满足无标记成像的需求。这些量化数据为FxClear技术的有效性提供了有力的证据，让研究结论更加科学可靠。
总结与展望
FxClear技术为脑科学研究提供了简单可靠的无标记成像方法，可清晰观察大脑结构和病理变化，助力神经科学和病理学研究，推动神经系统疾病机制探索与早期诊断。在临床诊断领域，其无标记成像特性有助于更简便获取大脑信息，为脑损伤和退行性疾病诊断、治疗方案制定提供依据。然而，FxClear技术存在局限，难以识别细胞异质性，且自制成像系统不利于结果比较。未来，需结合其他技术增强细胞层面信息获取能力，开发标准化设备与方法，为生命科学发展带来新突破。
论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Lee B, Lee E, Kim JH, Kim HJ, Kang YG, Kim HJ, Shim JK, Kang SG, Kim BM, Kim K, Kim Y, Cho K, Sun W. Sensitive label-free imaging of brain samples using FxClear-based tissue clearing technique. iScience. 2021 Mar 5;24(4):102267.
DOI:10.1016/j.isci.2021.102267.