研究背景：

心源性猝死（SCD）在心血管疾病死亡中占比较高，恶性室性心律失常是其常见病因，由心肌在结构或功能压力下发生的结构和电生理重塑引起。以往研究显示：线粒体功能障碍与心律失常发生相关，ATP合成减少、ROS生成增加会引发细胞和离子功能异常从而导致心律失常。ROS通过氧化并激活Ca²⁺/钙调素依赖性激酶II（CaMKII）诱发心律失常。曾有报道表明Pak1激活的信号通路可保护心肌细胞免受缺血和肥大应激，其引发的肌膜和线粒体功能失调可能成为改善心律失常的治疗靶点。

新研究发现Pak2参与心脏稳态的细胞调节，是离子通道活性、钙处理和心脏收缩的关键。心脏特异性缺失Pak2的小鼠在内质网应激或压力超负荷时会出现内质网应激反应缺陷、心脏功能障碍和心肌细胞死亡，基因芯片分析显示这涉及IRE1/XBP1信号通路。而诱导Pak2激活可改善内质网功能和心脏性能，减少细胞凋亡并预防心力衰竭，这些发现暗示Pak2介导的内质网应激调节在心肌肥厚中具有心脏保护作用。

当前缺失Pak2在线粒体氧化应激和心脏损伤中保护作用的直接证据，基于此，西南医科大学谭晓秋/雷鸣/张春祥教授团队在Advanced Science杂志发表题为"P21-Activated Kinase 2 as a Novel Target for Ventricular Tachyarrhythmias Associated with Cardiac Adrenergic Stress and Hypertrophy"的文章，揭示了Pak2在心脏肾上腺素应激和肥厚相关的室性心律失常中的关键作用和干预价值，Pak2是开发新型有效抗心律失常药物的潜在靶点。

研究方法：
本研究通过高分辨荧光标测（optical mapping）技术比较Langendorff灌注的Pak2^cko 和Pak2^f/f 心脏及心肌细胞的APD、CaT等电生理指标的变化；此外，同时对不同组小鼠心脏电交替、异位搏动、折返激动等现象进行监测。

研究结果：
1. Pak2缺失破坏Ca²⁺稳态并增加室性心律失常的易感性
探究在急性异丙肾上腺素诱导的心脏肾上腺素能应激和慢性TAC致心室肥厚情况下，Pak2信号传导对心室致心律失常倾向的保护作用。对比Pak2缺失（Pak2^cko）和Pak2^f/f小鼠在有无TAC应激时体内外心脏电稳定性和钙离子处理情况。结果显示，正常状态下两组小鼠部分心电指标相似，但Pak2^cko小鼠QT间期延长；急性异丙肾上腺素应激下，Pak2^cko小鼠室性心动过速发生率更高；TAC处理5周后，Pak2表达下调，且Pak2^cko/TAC小鼠心脏肥厚和功能障碍更严重，室性异位搏动和VT/VF发生次数增多，同时其总体生存率因Pak2缺乏和TAC刺激联合作用而显著降低。

图1. 心脏Pak2的缺失增加了小鼠在急性异丙肾上腺素或慢性TAC刺激下的心律失常易感性

进一步通过高分辨荧光标测（optical mapping）及膜片钳等技术，比较了Langendorff灌注的Pak2^cko和Pak2^f/f心脏及心肌细胞的电生理变化。基础状态下两组心脏室性心律失常发生率无差异，但急性异丙肾上腺素刺激使Pak2^cko心脏VT发生率增加，且 Pak2^cko/TAC心脏室性心律失常发生率更高。

Pak2^cko及Pak2^cko/TAC心脏和心肌细胞的APD和CaT增加。TAC和Pak2缺失使钙交替发生率和频率增加，且加剧了异丙肾上腺素对钙交替频率的影响，同时Pak2缺乏加剧了TAC诱导的Vm/CaT延迟增加。Pak2^cko/TAC心脏出现APD交替，引发异位搏动、折返激动及折返路径形成，且不同异位搏动位点会改变动作电位传导方向，形成折返性心律失常路径。

图2. 心脏Pak2的缺失加剧了TAC处理后离体心脏室性心律失常和钙交替的易感性

2. Pak2过表达可缓解异丙肾上腺素或TAC诱导的心律失常
作者构建了可诱导心脏特异性过表达野生型Pak2的小鼠Pak2^ctg模型。超声心动图显示该模型和对照小鼠心脏功能正常。Pak2^ctg小鼠经异丙肾上腺素刺激后，室性心律失常发生率和持续时间降低；TAC处理7周，对照小鼠室性异位搏动频率大幅增加，而Pak2^ctg/TAC组小鼠室性异位搏动频率显著降低，且Pak2激活抑制了压力超负荷诱导的心肌肥厚。

在电生理和钙离子相关指标上，Pak2^ctg/TAC心脏未出现如Pak2^cko心脏类似的膜电位、钙离子光学标测重构以及钙交替，而WT/TAC心脏则显示出有折返激动形成、折返现象以及异常钙离子处理与膜电位耦合的特征。

图3. 心脏特异性Pak2过表达可减弱异丙肾上腺素或TAC诱导的心律失常和Ca²⁺交替发生

3. 分离的单个Pak2^cko心室肌细胞表现出异常的钙离子动态变化
接下来，作者研究了Pak2^cko、Pak2^cko/TAC、Pak2^f/f和Pak2^f/f/TAC心室肌细胞中的Ca²⁺瞬变。急性异丙肾上腺素和慢性5周TAC刺激心脏中的Pak2^cko肌细胞比相应的对照组显示出更高的自发Ca²⁺瞬变（SCT）和Ca²⁺振荡（CO）的发生率。此外，Pak2^cko/TAC心肌细胞显示Ca²⁺瞬变衰减时间常数明显延长。

图4. Pak2的缺失加重了异丙肾上腺素和TAC诱导的心脏细胞内钙稳态的破坏

4. Pak2^cko心脏中线粒体生物合成缺陷和氧化磷酸化
为了确定潜在的信号通路，作者对Pak2^cko、Pak2^cko/TAC、Pak2^f/f和Pak2^f/f/TAC小鼠的心室组织进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。

多组比较发现大量差异表达蛋白与心脏应激相关，Pak2^cko/TAC小鼠应激相关蛋白水平升高。KEGG和GO富集分析显示Pak2^cko/TAC心脏氧化磷酸化相关代谢途径富集。进一步分析表明不同组间蛋白质和磷酸化蛋白质有显著差异及部分重叠，且蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学变化存在显著相关性，对差异蛋白富集分析后发现氧化磷酸化和三羧酸循环通路相关蛋白在两种组学中的表达趋势高度一致。

研究运用WGCNA（加权基因共表达网络分析） 方法探究与样本表型相关的蛋白质及磷酸化蛋白质模块。对四组蛋白质组学数据预处理后，构建加权网络并经层次聚类分析得到五个蛋白质模块，这些模块以不同的颜色命名，如蓝色模块，黄色模块等，其中青绿色模块与表型严重程度显著相关。对其进行KEGG和GO通路富集分析，发现与心肌病、氧化磷酸化等过程有关。同样用该方法分析磷酸化蛋白质模块，经层次聚类得到18个模块，青绿色模块与表型严重程度显著相关，富集分析显示其与心肌病和三羧酸循环有关。

图5. Pak2缺失加重了TAC诱导的心脏氧化应激

本研究对不同组（Pak2^f/f/TAC、Pak2^cko/TAC及相应假手术组）的氧化应激、线粒体结构和功能进行探究。发现TAC诱导的慢性心脏应激使 Pak2^f/f/TAC和Pak2^cko/TAC组ROS水平显著高于假手术组，且Pak2^cko/TAC组ROS水平高于 Pak2^f/f/TAC组。通过透射电镜观察到 Pak2^cko/TAC心肌细胞线粒体结构异常更突出，同时该组ATP生物合成显著减少，与线粒体形态变化相符。

通过差异蛋白质组学分析发现，与应激相关的蛋白质在线粒体中最为富集。对比不同组小鼠，Pak2^cko/TAC小鼠线粒体中差异蛋白数量与其他组存在差异。进一步分析显示，Pak2^cko/TAC心脏的线粒体电子传递链复合物I-V显著少于其余三组，且其复合物I （NDUFs）的表达和活性显著下调。同时表明，单独的Pak2缺乏不足以导致明显的损伤。

5. NOX4/ROS介导的CaMKII通路激活有助于Pak2在TAC诱导的心脏电重构中的作用
电生理实验发现细胞内钙离子动态、膜电位-钙信号耦连异常，进一步对比不同组心脏中相关蛋白表达。结果显示，Pak2^cko/TAC心脏中NOX4显著增加，不同组NOX2表达相似；Pak2^cko/TAC小鼠的ox-CaMKII、p-CaMKII表达和ROS水平高于Pak2^cko小鼠，Pak2^f/f/TAC小鼠也高于Pak2^f/f小鼠，且Pak2基因敲除加剧异丙肾上腺素刺激对NOX4、CaMKII和ROS产生的影响。测量耗氧率发现，TAC处理降低了氧气消耗率（OCR），Pak2基因敲除加重了TAC诱导的线粒体功能障碍。

图6. Pak2缺失通过损害线粒体功能从而加重心功能障碍

6. Pak2过表达可挽救异丙肾上腺素和TAC诱导的线粒体结构和功能损伤
对比Pak2^ctg、Pak2^ctg/TAC、Pak2WT和Pak2WT/TAC的实验表明，与Pak2^cko相比，Pak2过表达减少了ROS的产生，改善了TAC引起的线粒体变化。Pak2^ctg/TAC心肌细胞显示线粒体异常数量减少。作者研究了NOX4/ROS/CaMKII通路可能参与Pak2过表达的心脏保护作用。Pak2^ctg/TAC心肌细胞的NOX4、ox-和p/t-CaMKII表达低于Pak2WT/TAC心肌细胞。最后，即使在异丙肾上腺素浓度加倍的情况下，急性异丙肾上腺素激发的Pak2^ctg心脏中ROS生成和p-CaMKII表达的增加也低于Pak2WT，表明Pak2过表达可能通过 NOX4/ROS/CaMKII信号通路发挥心脏保护作用。

图7. 心脏特异性Pak2过表达可缓解TAC或异丙肾上腺素诱导的心脏氧化应激和线粒体结构异常

7. Pak2激活剂JB2019A可缓解急性异丙肾上腺素刺激和慢性TAC诱导的心肌肥厚的促心律失常作用，减少线粒体结构损伤和ROS的产生
为了研究Pak2作为治疗心肌肥厚和心律失常的新靶点的可行性，作者开发了小分子Pak2激活剂JB2019A，其剂量依赖性激活Pak2。通过软件对接发现它结合于Pak2自抑制结构域内位点，JB2019A诱导Pak2的变构改变，稳定其活性形态，Western blotting证实其能增加磷酸化Pak2表达。在急性肾上腺素能和慢性TAC应激条件下，JB2019A激活Pak2的增加减少了心律失常和心脏重构。在急性异丙肾上腺素刺激下，能显著降低Pak2^f/f 小鼠VT发生率，但对Pak2^cko小鼠影响较小。

图8. Pak2激活剂JB2019A可减轻TAC诱导的心肌肥厚、降低室性心律失常的易感性

在野生型心脏中，TAC刺激显著增加室性异位搏动发生率，JB2019A可使其明显降低。JB2019A能改善TAC诱导的心肌肥厚，单独使用时对心肌细胞横截面积和HW/BW比值无影响。超声心动图表明JB2019A可挽救TAC导致的心脏功能障碍。此外，JB2019A处理可减少氧化应激，降低ROS水平和线粒体结构变化，抑制TAC诱导的ox-CaMKII增加，对CaMKII信号通路的抑制或能抵御氧化应激和线粒体损伤，提供抗心律失常的潜在靶点。

最后，作者检测了人类心脏组织中Pak2和NOX4的表达，发现与窦性心律患者相比，接受体外循环的房颤患者心房附件组织中Pak2表达下降，NOX4表达升高 。

图9. Pak2激活剂JB2019A可减轻TAC诱导的心脏氧化应激和线粒体结构异常

结论：
综上，本研究首次揭示了Pak2在心脏应激和肥厚相关室性心律失常中的保护作用。Pak2通过调控线粒体功能和ROS生成，维持细胞内钙稳态，从而减少心律失常的发生。Pak2激动剂JB2019A的开发为未来抗心律失常药物的研发提供了新的方向。