一、犬心丝虫抗原特性与靶抗原筛选
（一）犬心丝虫关键抗原蛋白
成虫抗原（Adult Antigen）
抗原 P（AgP）：成虫分泌排泄抗原（ES 抗原）中的主要免疫原性蛋白，分子量约 24 kDa，与宿主免疫反应密切相关。
热休克蛋白（HSP70/HSP90）：保守性高，参与虫体应激反应，免疫原性强。
微丝蚴表面蛋白（MSP）：存在于微丝蚴（L1 期）表面，用于早期感染检测。
抗原选择依据
诊断应用：优先选择成虫 ES 抗原（如 AgP），因其在感染犬血清中可检测到特异性抗体，且与其他丝虫（如恶丝虫）交叉反应低。

二、抗犬心丝虫单克隆抗体（mAb）的制备流程
（一）抗原制备与动物免疫
重组抗原表达
基因克隆：从犬心丝虫成虫 cDNA 文库中扩增 AgP 基因，插入 pET 系列原核表达载体，转化 E. coli BL21 (DE3) 菌株。
蛋白表达与纯化：IPTG 诱导表达后，通过 Ni-NTA 亲和层析纯化重组 AgP 蛋白，SDS-PAGE 验证纯度（＞95%），BCA 法测定浓度。
Balb/c 小鼠免疫方案
初次免疫：重组 AgP 蛋白（50 μg / 只）与弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射。
加强免疫：每 2 周用弗氏不完全佐剂乳化抗原（25 μg / 只） booster，共 3 次；末次免疫前 3 天，尾静脉注射纯抗原（无佐剂）加强。
效价检测：免疫后 7 天采集小鼠血清，间接 ELISA 检测抗 AgP 抗体效价（≥1:10,000 视为合格）。

（二）杂交瘤细胞构建与筛选
脾细胞与骨髓瘤细胞融合
脾细胞制备：取效价最高的免疫小鼠脾脏，研磨成单细胞悬液，计数；
细胞融合：脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞按 5:1 比例混合，50% PEG1500 诱导融合，接种于 HAT 选择性培养基，37℃、5% CO₂培养。

阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化
初筛：融合后 10-14 天，取培养上清，以重组 AgP 蛋白为包被抗原，间接 ELISA 筛选阳性孔。
克隆化：对阳性孔细胞采用有限稀释法（1 cell/well）克隆化，重复 3 次，直至单克隆细胞株稳定分泌抗体。

（三）单克隆抗体的制备与纯化
腹水制备
预处理：6-8 周龄 Balb/c 小鼠腹腔注射降植烷（0.5 mL / 只），7 天后注射阳性杂交瘤细胞（1×10⁶ cells / 只）。
腹水收集：注射后 7-14 天，收集腹水，4℃离心（3000 rpm，10 min），取上清。

抗体纯化与鉴定
亚型测定：ELISA 法确定抗体亚型（如 IgG1、IgG2a 等）；
特异性验证：Western blot 检测抗 AgP mAb 与犬心丝虫成虫提取物的结合特异性，同时验证与其他寄生虫（如犬蛔虫、钩虫）抗原的交叉反应。
Protein G 亲和层析：腹水经 0.22 μm 滤膜过滤后，上样至 Protein G 柱，用甘氨酸 - HCl 缓冲液（pH 3.0）洗脱，立即用 1 M Tris-HCl（pH 8.0）中和，PBS 透析脱盐。

鉴定指标：
三、抗犬心丝虫单克隆抗体的应用
（一）免疫诊断：双抗体夹心 ELISA 检测犬心丝虫抗原

实验原理
包被抗 AgP mAb（捕获抗体）于 96 孔板，待检血清中的犬心丝虫循环抗原（CAg）与捕获抗体结合，再与生物素标记的抗 AgP mAb（检测抗体）反应，最后通过链霉亲和素 - HRP 显色，OD 值判定阳性。

操作流程
包被：捕获抗体（10 μg/mL）4℃包被过夜，5% BSA 封闭 2 h；
加样：待检血清（1:100 稀释）37℃孵育 1 h，洗涤后加生物素标记抗体（1:5000），37℃孵育 1 h；
显色：TMB 底物显色 15 min，2 M H₂SO₄终止，酶标仪测 450 nm OD 值（cut-off 值 = 阴性对照 OD 均值 ×2.1）。

临床价值
该方法可检测感染后 3-4 个月的犬心丝虫 CAg，灵敏度＞95%，特异性＞98%，优于传统微丝蚴检测法（需感染 6 个月后才能检出）。

（二）免疫层析试纸条（胶体金法）的制备
试纸条设计
检测线（T 线）：包被抗 AgP mAb（1 mg/mL）；
质控线（C 线）：包被羊抗鼠 IgG（1 mg/mL）；
结合垫：胶体金标记抗 AgP 另一表位 mAb（20 μg/mL），干燥后组装。

检测流程
犬血清或血浆滴加至样品垫，若含 CAg，金标抗体与抗原结合，迁移至 T 线时被捕获抗体识别，形成红色条带，C 线显色验证试纸条有效性。
优势：10-15 分钟出结果，适合现场快速筛查，与 ELISA 符合率＞90%。

（三）Western blot 检测犬心丝虫蛋白表达
应用场景
研究犬心丝虫感染过程中 AgP 蛋白的表达规律，或评估药物（如伊维菌素）对虫体抗原表达的影响。
实验要点
成虫或微丝蚴裂解物经 SDS-PAGE 分离后转膜，抗 AgP mAb（1:1000）孵育，HRP 标记羊抗鼠 IgG（1:5000）显色，ECL 曝光后可见 24 kDa 特异性条带。

四、单克隆抗体应用的关键优化与挑战
交叉反应控制
犬心丝虫与猫心丝虫（D. cati）、恶丝虫（D. repens）存在部分抗原同源性，需用这些虫种的抗原验证 mAb 特异性，避免误诊。

抗体稳定性改良
免疫层析用 mAb 需经耐盐实验（如 0.1-0.5 M NaCl）和长期保存实验（4℃、37℃加速老化）验证稳定性，必要时通过抗体工程改造（如定点突变）提高热稳定性。

早期感染检测的局限性
单克隆抗体检测 CAg 适用于成虫感染阶段（≥3 个月），对微丝蚴期（L1）感染灵敏度较低，需结合抗微丝蚴 mAb 开发联合检测方法。

五、拓展应用：犬心丝虫疫苗研发与免疫机制研究
疫苗候选抗原筛选
抗 AgP mAb 可用于筛选能诱导中和抗体的抗原表位，辅助亚单位疫苗设计（如重组 AgP 蛋白疫苗）。
虫体 - 宿主互作研究
通过 mAb 标记 AgP 蛋白在虫体中的定位（免疫荧光或免疫电镜），探究其在虫体入侵、免疫逃逸中的作用。

六、总结
抗犬心丝虫单克隆抗体凭借高特异性和稳定性，在犬心丝虫病的快速诊断（ELISA、免疫层析）、基础研究（抗原表达分析）及疫苗开发中具有重要价值。通过优化抗体制备工艺和检测方法，可进一步提升其在犬心丝虫病防控中的应用效能，尤其适用于大规模流行病学调查和临床早期筛查。