抗猪肺炎支原体（Mhp）单克隆抗体的抗体特性、制备方法及特异性
2025-06-23 来源:本站 点击次数:134抗猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）单克隆抗体的相关参数需结合其病原特性、制备工艺及应用场景确定，以下从毒株型号、抗体特性、制备方法及特异性等方面详细介绍：
一、猪肺炎支原体常用毒株型号
猪肺炎支原体是引起猪支原体肺炎（喘气病）的病原，其毒株型号根据分离地区和时间不同而有所差异，常见毒株如下：
国际标准毒株：
J 株：最早从美国病猪中分离，是研究和疫苗生产的经典毒株，基因组序列已公布（GenBank 登录号：CP006945）。
232 株：美国分离株，常用于疫苗效力评价和抗体检测标准品。
中国流行毒株：
168 株：中国早期分离的强毒株，用于国内疫苗（如猪肺炎支原体灭活疫苗）的生产。
HN06 株、SH 株：近年国内流行的高毒力变异株，其黏附蛋白（如 P97、P102）抗原性与经典毒株存在差异。
其他地区毒株：如欧洲的 7448 株、澳大利亚的 AP 株等，不同毒株的表面蛋白（如 P97、P65、P116）氨基酸序列同源性约 85%~95%，但部分高变区可能影响抗体识别。
二、抗猪肺炎支原体单克隆抗体的特性
抗体类型与亚型
单克隆抗体（mAb）多为 IgG 类，常见亚型为 IgG1 或 IgG2a（取决于小鼠品系，如 BALB/c 小鼠制备的抗体），少数为 IgM（初筛阶段可能出现）。
抗体效价与亲和力
效价：间接 ELISA 检测中，腹水抗体效价通常≥1×10⁶，细胞培养上清效价≥1×10⁴，高亲和力抗体可通过生物层干涉技术（BLI）或表面等离子共振（SPR）测定，KD 值可达 10⁻⁹~10⁻¹¹ M。
三、抗猪肺炎支原体单克隆抗体制备方法及关键参数
（一）制备流程关键步骤
抗原制备
天然抗原：培养 Mhp 菌株（如 J 株、168 株），通过超声波破碎或冻融法释放抗原，经超离心和层析纯化获得全菌抗原或表面蛋白（如 P97、P65）。
重组抗原：利用原核（如 E. coli）或真核（如毕赤酵母）表达系统制备重组 P97 蛋白（尤其是 C 端高保守区 P97ⁿⁱᵇ），纯度需≥95%（SDS-PAGE 检测）。
动物免疫
免疫方案：6~8 周龄 BALB/c 小鼠，皮下或腹腔注射抗原（50~100 μg / 只），佐剂（弗氏完全佐剂 / 不完全佐剂）混合，免疫周期 4~6 周，末次免疫后 3 天取脾细胞。
杂交瘤细胞制备
脾细胞与骨髓瘤细胞（如 SP2/0）按 5:1 比例融合，PEG 1500（50% 浓度）诱导融合，融合效率约 10%~20%，需在 HAT 培养基中筛选杂交瘤细胞。
抗体筛选
双筛选策略：
ELISA 筛选：以 Mhp 抗原包被，检测培养上清与 J 株、168 株等毒株的结合活性。
免疫荧光（IFA）或 Western blot：验证抗体对 Mhp 天然蛋白的识别能力，排除识别培养基杂质的假阳性。
中和试验（可选）：部分研究通过 Mhp 黏附抑制试验筛选能阻断细菌黏附宿主细胞的中和抗体（如抑制 P97 与猪气管上皮细胞结合）。
克隆化与抗体生产
有限稀释法克隆化 2~3 次，确保单克隆性；腹水诱生法（腹腔注射 Pristane 预处理小鼠）可获得高浓度抗体（1~10 mg/mL），细胞培养法适用于大规模纯化。
（二）制备关键参数
抗原纯度：重组 P97 蛋白需通过 Ni-NTA 层析和凝胶过滤纯化，内毒素含量＜0.1 EU/μg（鲎试剂检测），避免免疫反应干扰。
融合后筛选阳性率：初次筛选中，阳性杂交瘤细胞比例通常＜5%，需通过多轮克隆化提高稳定性。
四、抗猪肺炎支原体单克隆抗体的特异性
抗原特异性
种属特异性：理想抗体应仅识别 Mhp，与其他猪支原体（如猪鼻支原体、猪关节炎支原体）无交叉反应，可通过交叉 ELISA 验证：与其他支原体的交叉反应率＜5%。
毒株广谱性：针对 P97 等保守蛋白的抗体需能识别 J 株、168 株、HN06 株等流行毒株，ELISA 结合活性差异≤20%。
表位特异性
中和表位：靶向 P97ⁿⁱᵇ结构域（如氨基酸残基 459~516）的抗体具有黏附抑制活性，中和效价（抑制 50% 黏附的抗体浓度）＜10 μg/mL。
非中和表位：靶向 P65、P116 等表面蛋白的抗体常用于诊断（如 ELISA、免疫组化），但无中和功能。
应用场景特异性
诊断用抗体：需对 Mhp 抗原具有高敏感性（检测限＜10 ng/mL），且能区分活疫苗株（如 168 株）与野毒株（如 HN06 株）。
治疗用抗体：需兼具高中和活性和低免疫原性，可通过抗体人源化改造降低异种免疫反应。
五、典型单克隆抗体实例（参考研究数据）
抗体编号靶向抗原亚型中和活性（黏附抑制率）交叉反应应用
4B7 P97ⁿⁱᵇ（C 端） IgG1 85%（10 μg/mL） 与猪鼻支原体＜1% 中和治疗、诊断
2F5 全菌膜蛋白 IgG2a 无 与 Mhp 各毒株结合率＞95% 免疫组化（肺组织检测）
7C11 重组 P65 蛋白 IgG1 无 与其他支原体交叉率＜3% ELISA 检测抗原捕获
六、注意事项
毒株变异影响：近年流行的 Mhp 高毒力株（如中国 HN06 株）在 P97 基因的可变区（VR1、VR2）存在氨基酸突变，制备的抗体需验证对变异株的识别能力，避免诊断假阴性。
抗体应用优化：用于猪群检测时，需考虑猪血清中天然抗体的干扰（如使用竞争 ELISA 法）；治疗用抗体需通过猪攻毒实验验证保护效果（如降低肺病变评分）。
如需更具体的参数，可参考《Veterinary Microbiology》等期刊中 Mhp 单克隆抗体制备的研究文献，或咨询商业抗体供应商（如 VMRD、Biosera）的技术资料。
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