抗犬冠状病毒（CCV）抗体的制备及在 WB、免疫层析中的应用
一、抗犬冠状病毒（CCV）抗体的制备
（一）抗原制备：CCV 关键抗原的筛选与表达
CCV 抗原蛋白选择
核衣壳蛋白（N 蛋白）：免疫原性强，保守性高，是制备抗体的首选抗原（可通过基因工程表达重组 N 蛋白）。
棘突蛋白（S 蛋白）：含中和表位，可用于制备中和抗体，但空间构象复杂，表达难度较高。
重组抗原的表达与纯化
基因克隆：从 CCV 毒株（如 Mebus 株）中扩增 N 蛋白或 S 蛋白基因，插入原核（如 E. coli）或真核表达载体（如昆虫细胞）。
蛋白表达与纯化：通过 IPTG 诱导原核表达，利用 Ni-NTA 亲和层析或凝胶过滤纯化重组蛋白，确保抗原纯度（＞95%）。

（二）多克隆抗体（pAb）制备流程
动物免疫
初次免疫：重组抗原与弗氏完全佐剂等体积乳化，背部多点皮下注射（抗原量 50-100 μg / 只）。
加强免疫：每 2-3 周用弗氏不完全佐剂乳化抗原 booster 免疫，共 3-4 次，每次抗原量 50 μg / 只。
效价检测：末次免疫后 7-10 天，采集少量血清，通过 ELISA 检测抗体效价（≥1:10,000 视为合格）。
免疫动物选择：健康成年新西兰白兔（体重 2-3 kg）或 Balb/c 小鼠，免疫前采集血清作为阴性对照。

免疫方案：
抗体纯化与鉴定
血清采集与粗提：颈动脉采血或心脏采血，分离血清，通过硫酸铵沉淀法（40% 饱和度）初步纯化 IgG。
亲和层析纯化：使用 Protein A/G 琼脂糖树脂进一步纯化抗体，去除杂蛋白，通过 SDS-PAGE 验证纯度。

（三）单克隆抗体（mAb）制备流程
杂交瘤细胞构建
脾细胞制备：对免疫后抗体效价高的小鼠（如 Balb/c），取脾脏研磨成单细胞悬液。
细胞融合：与骨髓瘤细胞（如 SP2/0）在 PEG 作用下融合，接种于 HAT 选择性培养基，筛选杂交瘤细胞。
克隆化与筛选：通过有限稀释法克隆化杂交瘤细胞，利用间接 ELISA 筛选能稳定分泌抗 CCV 抗体的细胞株。
腹水制备与抗体纯化
小鼠腹腔注射：将阳性杂交瘤细胞注射至经降植烷预处理的小鼠腹腔，7-10 天后收集腹水。
抗体纯化：腹水经 Protein G 亲和层析纯化，通过 ELISA 和 Western blot 验证抗体特异性。

二、抗 CCV 抗体在 Western Blot（WB）中的应用
（一）WB 检测 CCV 的实验流程
样品制备
感染 CCV 的犬肠组织或细胞培养物，经超声破碎或反复冻融后，离心取上清，BCA 法测定蛋白浓度。
电泳与转膜
SDS-PAGE 电泳：将样品与 Loading Buffer 混合，95℃变性 5 min，上样至 10% SDS-PAGE 凝胶，80-120 V 电泳至蛋白分离。
转膜：湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜（200 mA，1-2 h），用 5% 脱脂奶粉或 BSA 封闭 1 h（室温）。

抗体孵育与显色
一抗孵育：抗 CCV 多克隆抗体或单克隆抗体（1:1000-1:5000 稀释），4℃孵育过夜。
二抗孵育：HRP 标记的羊抗兔 / 鼠 IgG（1:5000 稀释），室温孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次（每次 10 min）。
显色：ECL 化学发光试剂孵育膜 5 min，曝光显影，观察 CCV 特异性条带（N 蛋白约 50 kDa，S 蛋白约 180 kDa）。

（二）关键注意事项
抗体特异性验证：需设置未感染 CCV 的阴性对照，排除非特异性结合。
封闭剂选择：部分抗体可能与脱脂奶粉中的蛋白交叉反应，可改用 BSA 封闭。

三、抗 CCV 抗体在免疫层析中的应用
（一）免疫层析试纸条的设计原理
检测原理：基于双抗体夹心或竞争法，以抗 CCV 抗体作为捕获抗体（固定于硝酸纤维素膜 NC 膜的检测线 T 线）和标记抗体（胶体金或乳胶微球偶联，作为示踪物）。

（二）双抗体夹心法试纸条制备流程
材料准备
NC 膜：包被抗 CCV mAb（T 线，1-2 mg/mL）和羊抗鼠 IgG（C 线，1 mg/mL）；
结合垫：胶体金标记抗 CCV 另一表位的 mAb（标记抗体，10-20 μg/mL），干燥备用。
试纸条组装与切割
按顺序组装样品垫、结合垫、NC 膜、吸水垫，用层析卡壳固定，切割成 3-4 mm 宽的试纸条。
检测流程若样品含 CCV，标记抗体与病毒结合，迁移至 T 线时被捕获抗体识别，形成 “金标抗体 - 病毒 - 捕获抗体” 复合物，显红色条带；
线为质控线，无论样品是否阳性均应显色，验证试纸条有效性。
样品（犬粪便悬液或血清）滴加至样品垫，通过毛细作用迁移：

（三）竞争法检测设计（适用于小分子抗原，此处以 CCV 为例）
若抗体识别病毒表面短肽表位，可设计竞争法：
T 线包被 CCV 重组抗原，结合垫标记抗 CCV 抗体；
样品中若含 CCV，标记抗体优先与病毒结合，导致 T 线抗原结合的标记抗体减少，条带颜色变浅或消失，通过颜色强度判断阳性程度。

四、抗体应用的关键优化点
抗体效价与亲和力
WB 检测需高亲和力抗体（降低背景信号），免疫层析需兼顾效价与稳定性（标记抗体需耐盐、耐蛋白酶）。
交叉反应验证
犬冠状病毒与猫冠状病毒（FCoV）、犬细小病毒（CPV）等可能存在低同源性，需用交叉抗原（如 FCoV）验证抗体特异性，避免假阳性。

临床样本适用性
免疫层析试纸条需用临床确诊的 CCV 阳性粪便（≥100 份）和阴性样本（健康犬、其他肠道疾病犬）验证灵敏度（≥90%）和特异性（≥95%）。

五、应用价值与展望
疾病快速诊断：免疫层析试纸条可用于犬冠状病毒感染的现场快速检测，适合基层临床和流行病学调查。
科研与疫苗评价：WB 检测可用于 CCV 感染细胞或动物模型中病毒蛋白表达的定性 / 定量分析，辅助疫苗免疫效果评估。后续优化方向：通过抗体人源化或纳米抗体改造，提高抗体稳定性
和检测灵敏度，开发 POCT（即时检测）产品。
通过合理设计抗体制备流程及检测方法，抗 CCV 抗体可在犬冠状病毒的诊断、研究及防控中发挥关键作用。