方案摘要：牛传染性胸膜肺炎（Contagious Bovine Pleuropneumonia，CBPP)是由丝状支原体丝状亚种（Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides，Mmm）引起的一种牛属动物传染病,又称牛肺疫。以肺小叶间淋巴管浆液-渗出性纤维素性炎和浆液纤维素性胸膜炎为特征。健康牛与感染牛直接接触后吸入感染牛的“飞沫”是本病的主要传染途径，其中感染牛的“飞沫”是传播媒介，本病也可通过感染牛的精液和胚胎造成垂直传播。本方案使用了日本进口产品，Pipetty电动移液器，利用其体积小，精度高的优势，有效减少使用者的手部疲劳的同时大幅度提升了检测效率。
 
方案详情：

• 实验原理

牛传染性胸膜炎PCR 实验，以牛支原体为检测对象，核心是特异性扩增其 16S rRNA 保守基因。通过专属引物（仅与该基因序列互补结合），在 PCR 仪中经 30-40 次循环：94-95℃变性使 DNA 解旋，55-65℃退火让引物结合模板，72℃时 Taq 酶催化合成新链，实现靶基因指数级复制。扩增后经琼脂糖凝胶电泳，若出现预期大小条带为阳性（含病原），反之则为阴性，实现定性检测。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250及配套吸头；
② PCR仪；
③ 高速台式冷冻离心机；
④ 瞬时离心机；
⑤ 涡旋混匀器。
 
2、试剂和材料
① 商品化基因组 DNA 提取试剂盒（商品化试剂）；
② 引物；
③ 八连管或96孔板；
④ XPCR 反应预混合液（含 Tag 酶和染料）；
⑤ 阳性对照：pUC-TM 质粒；
⑥ 阴性对照：无核酸酶水；
⑦ DNA 分子质量标准；
⑧ 1%琼脂糖凝胶。
 
三、实验步骤
1、使用商品化的基因组 DNA 提取试剂盒提取鼻拭子、血液、组织和体液样品的基因组 DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。
 
2、标记96孔板，设置阴性对照和阳性对照，按表1反应体系将各试剂按需要的孔数加到EP管内，使用Pipetty的自动混匀模式，对试剂进行充分混合。使用Pipetty电动移液器，设置连续分液，将预混后的试剂，移取至96孔板中。取样品 DNA模板，按每孔/2μL，连续加入到96孔板内，短暂离心后，进行 PCR 扩增。
 
3、扩增程序为 95 ℃预变性 3min；94℃45s，57℃45s，72℃1min，35 个循环；72 ℃延伸 10min。以1%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。
 
四、结果判定
1、阴性对照不能扩增出任何条带，且阳性对照扩增出 300 bp 左右片段，则 PCR结果判定为有效。如阳性对照不能扩增出目的大小片段，或阴性对照扩增出目的片段，则 PCR 反应无效。
2、待检样品扩增出大小为 300bp 左右的一条特异性扩增条带，且与阳性对照条带分子质量大小相符，则待检样品判定为 Mmm 核酸阳性。
3、待检样品无特异性扩增条带，则判定为Mmm 核酸阴性。