Pipetty电动移液器在牛肺疫病原检测（竞争ELISA）中的应用
2025-09-01 来源:广州程淇生物 点击次数:49
方案摘要：牛传染性胸膜肺炎（Contagious Bovine Pleuropneumonia，CBPP）是由丝状支原体丝状亚种（Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides，Mmm）引起的一种牛属动物传染病，又称牛肺疫。以肺小叶间淋巴管浆液-渗出性纤维素性炎和浆液纤维素性胸膜炎为特征。健康牛与感染牛直接接触后吸入感染牛的“飞沫”是本病的主要传染途径，其中感染牛的“飞沫”是传播媒介，本病也可通过感染牛的精液和胚胎造成垂直传播。本方案使用了日本进口产品，Pipetty电动移液器，通过精准控制、流程优化、人体工程学设计三大核心优势，系统性解决了竞争 ELISA 实验中的关键痛点。其高精度分液能力确保抗原 - 抗体竞争比例的真实性，连续分液功能提升加样效率与实验可重复性，而轻量化设计则兼顾实验人员的健康与舒适度。对于追求检测灵敏度和通量平衡的实验室（如动物疫病防控、生物医药研发），是提升竞争 ELISA 检测质量的理想工具。
方案详情：
一、实验原理
牛肺疫病原检测（竞争 ELISA）以检测丝状支原体牛亚种（Mmm）抗原为目标，核心是 “抗原竞争结合特异性抗体”。首先将抗 Mmm 特异性抗体包被在 ELISA 微孔板（固相载体）上；随后向微孔同时加入待检样本与酶标记 Mmm 抗原，二者竞争抗体的有限结合位点 样本含 Mmm（阳性）时，待检抗原会抢占更多位点，使酶标抗原结合量减少，反之（阴性）则酶标抗原大量结合。洗涤去除游离成分后加底物，酶标抗原上的酶催化底物显色，通过酶标仪测吸光度（OD 值）判断：阳性样本因酶标抗原少，显色浅、OD 值低；阴性样本显色深、OD 值高，以此间接判定是否存在 Mmm 病原，该方法特异性强、抗干扰性好。
二、实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 酶标仪；
③ 恒温培养箱；
④ 振荡器；
⑤ 洗板机。
2、试剂和材料
① PBS 溶液（pH 7.4）；
② 洗涤缓冲液 PBST；
③ 血清稀释液及酶标抗体稀释液（简称稀释液）；
④ 阳性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）；
⑤ 阴性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）；
⑥ 羊抗鼠 IgG 辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）（商品化试剂）；
⑦ TMB（3'，3'，5'，5'-四甲基联苯胺）底物溶液（商品化试剂）；
⑧ 终止液；
⑨ ELISA 抗原包被板（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）：包被有 Mmm 膜蛋白并经过封闭处理的 96 孔 ELISA 板；
⑩ ELISA 加样槽。
三、实验步骤
1、使用前所有试剂需恢复至 18 ℃~26 ℃。试剂需轻摇或涡旋混匀，加不同样品需更换吸头，对照可加在微量反应板的任何位置。
2、使用稀释液将单抗进行 500 倍稀释（如：一块板需要 12 mL，将 24μL单抗加入 11.976 mL的稀释液）。
3、取一块未使用的 96 孔酶标板，使用Pipetty电动移液器1-250量程，设置连续分液功能，设定单次分液量以及需要的孔数，按表3所示加入所需体积的稀释液、对照、血清样品和单抗检测溶液。
4、从预反应板的每孔吸取 100 μL， 转移至 ELISA 抗原包被板上相应的孔中，盖上封口膜，置于 37 ℃孵育1h。
5、弃去孔内液体，每孔加入洗涤缓冲液 PBST 250 μL，孵育3min，弃去 PBST，重复洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍干。
6、使用Pipetty 5-1000量程，设置连续分液功能，每孔加入 100 μL 的酶标二抗，置于 37 ℃孵育 45 min。
7、再次弃去孔内液体，每孔加入洗涤缓冲液 PBST 250 μL，孵育3min，弃去 PBST，重复洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍干。
8、每孔加入 100 μL TMB 底物溶液，置于 37 ℃避光孵育 10 min。
9、每孔加入 100 μL 终止液，轻微振荡混匀后，置酶标仪中在波长 450 nm 下读取 OD 值（OD450），应在加入终止液后 5min 内完成读数。
四、结果判定
1、样品抑制率（Inhibition Percentage）按照公式（1）计算：
式中:
IPs 待检血清样品抑制率；
OD450-Mab 单抗对照在 450 nm 波长处的 OD 值；
OD450-cc 二抗对照在 450 nm 波长处的 OD 值；
OD450-S 待检血清样品在 450 nm 波长处的 OD 值。
2、试验成立条件
各组对照为如下结果时试验成立，否则应重复试验:
a) 阳性：IPs>50% 判为 Mmm 抗体阳性。
b) 阴性：IPs<50% 判为 Mmm 抗体阴性。
方案详情：
一、实验原理
牛肺疫病原检测（竞争 ELISA）以检测丝状支原体牛亚种（Mmm）抗原为目标，核心是 “抗原竞争结合特异性抗体”。首先将抗 Mmm 特异性抗体包被在 ELISA 微孔板（固相载体）上；随后向微孔同时加入待检样本与酶标记 Mmm 抗原，二者竞争抗体的有限结合位点 样本含 Mmm（阳性）时，待检抗原会抢占更多位点，使酶标抗原结合量减少，反之（阴性）则酶标抗原大量结合。洗涤去除游离成分后加底物，酶标抗原上的酶催化底物显色，通过酶标仪测吸光度（OD 值）判断：阳性样本因酶标抗原少，显色浅、OD 值低；阴性样本显色深、OD 值高，以此间接判定是否存在 Mmm 病原，该方法特异性强、抗干扰性好。
二、实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② 酶标仪；
③ 恒温培养箱；
④ 振荡器；
⑤ 洗板机。
2、试剂和材料
① PBS 溶液（pH 7.4）；
② 洗涤缓冲液 PBST；
③ 血清稀释液及酶标抗体稀释液（简称稀释液）；
④ 阳性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）；
⑤ 阴性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）；
⑥ 羊抗鼠 IgG 辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）（商品化试剂）；
⑦ TMB（3'，3'，5'，5'-四甲基联苯胺）底物溶液（商品化试剂）；
⑧ 终止液；
⑨ ELISA 抗原包被板（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）：包被有 Mmm 膜蛋白并经过封闭处理的 96 孔 ELISA 板；
⑩ ELISA 加样槽。
三、实验步骤
1、使用前所有试剂需恢复至 18 ℃~26 ℃。试剂需轻摇或涡旋混匀，加不同样品需更换吸头，对照可加在微量反应板的任何位置。
2、使用稀释液将单抗进行 500 倍稀释（如：一块板需要 12 mL，将 24μL单抗加入 11.976 mL的稀释液）。
3、取一块未使用的 96 孔酶标板，使用Pipetty电动移液器1-250量程，设置连续分液功能，设定单次分液量以及需要的孔数，按表3所示加入所需体积的稀释液、对照、血清样品和单抗检测溶液。
4、从预反应板的每孔吸取 100 μL， 转移至 ELISA 抗原包被板上相应的孔中，盖上封口膜，置于 37 ℃孵育1h。
5、弃去孔内液体，每孔加入洗涤缓冲液 PBST 250 μL，孵育3min，弃去 PBST，重复洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍干。
6、使用Pipetty 5-1000量程，设置连续分液功能，每孔加入 100 μL 的酶标二抗，置于 37 ℃孵育 45 min。
7、再次弃去孔内液体，每孔加入洗涤缓冲液 PBST 250 μL，孵育3min，弃去 PBST，重复洗涤4次，最后一次在吸水纸上拍干。
8、每孔加入 100 μL TMB 底物溶液，置于 37 ℃避光孵育 10 min。
9、每孔加入 100 μL 终止液，轻微振荡混匀后，置酶标仪中在波长 450 nm 下读取 OD 值（OD450），应在加入终止液后 5min 内完成读数。
四、结果判定
1、样品抑制率（Inhibition Percentage）按照公式（1）计算：
式中:
IPs 待检血清样品抑制率；
OD450-Mab 单抗对照在 450 nm 波长处的 OD 值；
OD450-cc 二抗对照在 450 nm 波长处的 OD 值；
OD450-S 待检血清样品在 450 nm 波长处的 OD 值。
2、试验成立条件
各组对照为如下结果时试验成立，否则应重复试验:
- Mab 对照平均 OD450应在 0.2~2.0 之间;
- 阳性对照样品抑制率应在 55%~110%之间;
- 阴性对照样品抑制率应<40%。
a) 阳性：IPs>50% 判为 Mmm 抗体阳性。
b) 阴性：IPs<50% 判为 Mmm 抗体阴性。
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