双光子-光声显微镜同步实现微血管140μm与神经元>300μm深层成像
2025-09-03 来源:本站 点击次数:63重要发现
01核心贡献：高速、大体积活体深组织三维成像
本研究的核心贡献在于创造性地将双光子激发（2PE）技术与光片照明（Light-sheetillumination）相结合，构建了一种新型显微镜系统——双光子光片显微镜（2P-LSM）。这一技术突破性地解决了在活体组织中，特别是在大脑皮层下深层区域，进行高速、大范围三维成像的难题。传统共聚焦显微镜受限于点扫描方式，成像速度慢且光毒性高；而传统单光子光片显微镜则难以穿透深层组织。2P-LSM则兼具了双光子激发的深层穿透、光学层析能力和光片照明的高速、低光毒性优势。
02关键光学技术与成像过程
双光子激发（2PE）原理应用：系统利用近红外飞秒脉冲激光作为激发光源。双光子激发过程要求荧光分子同时吸收两个长波长（低能量）光子，达到激发态。
这带来了显著优势：激发光波长更长（通常在~1000-1300nm范围），散射更少，穿透深度显著增加；激发只发生在物镜焦平面附近一个极小的体积内（光学层析），有效抑制了背景噪声，提升了成像信噪比（SNR）和对比度；同时，长波长光子能量较低，对生物样本的光损伤和光漂白效应大大降低。
光片照明（Light-sheetillumination）实现：与传统的点扫描2PE显微镜不同，本研究创新性地将激发光整形为一片薄而宽的光片。这片光片被侧向投射到样本中，仅照亮需要成像的焦平面。照明方式从点扫描变为面照明，这是实现高速成像的关键。
高速三维成像流程：
光片生成与投射：近红外飞秒激光经过光束整形光学元件（如柱面镜组）形成薄光片。
样本照明：该光片从侧面入射，照亮样本内部一个特定的焦平面（XY平面）。
荧光信号收集：位于照明光路垂直方向的另一套高数值孔径（NA）物镜收集被光片激发的样本自发荧光或标记荧光信号。
面探测：收集的荧光信号被传输到高速、高灵敏度的相机（如sCMOS相机）进行探测。相机一次曝光即可获取整个照明焦平面（一个光学切片）的图像，速度远快于点扫描。
三维层析：通过精密地沿Z轴（深度方向）移动样本或物镜，使光片依次照亮相邻的不同焦平面。对每个焦平面进行高速面探测成像，最终将这些二维切片图像组合起来，即可重构出样本的三维结构。
动态观测：快速重复上述三维成像过程，即可实现对活体样本内动态过程（如血流、钙信号）的高速三维电影拍摄。
研究者们利用2P-LSM系统对活体小鼠大脑进行了深入成像研究。
穿透深度与分辨率：实验成功实现了对小鼠大脑皮层下超过600微米深度的清晰成像，分辨率达到亚细胞水平（横向~1μm，轴向~5μm），清晰分辨了深层神经元胞体、树突棘以及精细的毛细血管网络结构。这显著超越了传统单光子光片显微镜在活体组织中的穿透极限。
成像速度与范围：系统能以高达10Hz的体积速率（即每秒完成10次完整的三维体积扫描）对数百微米尺度的组织体积进行成像。例如，可以在数秒内完成对整个小鼠丘脑区域（~600x600x600μm³）的高分辨率三维成像。
活体动态观测：成功捕捉了活体小鼠大脑深层区域（如丘脑、下丘脑）的多种快速动态生理过程。
神经元活动：利用基因编码钙指示剂（如GCaMP6），实时记录了深层神经元群体在数十赫兹频率下的钙瞬变活动，揭示了神经回路的活动模式。
血流动力学：通过注射荧光染料（如FITC-葡聚糖）标记血浆，清晰成像并量化了深层毛细血管网中的红细胞运动轨迹和速度，以及血管直径的瞬时变化。
免疫细胞行为：观察到小胶质细胞在深层脑区的动态形态变化和迁移行为。
低光损伤验证：长时间成像实验表明，与点扫描2PE相比，2P-LSM在相同成像深度和分辨率下，显著降低了光漂白和光毒性，使得对同一活体区域进行长时间（数小时）重复观测成为可能，这对研究长期生理过程至关重要。
实验结论明确：双光子光片显微镜（2P-LSM）是一种强大的活体三维成像工具，它成功结合了双光子激发的深层穿透、光学层析能力和光片照明的高速、低光毒性优势，首次实现了在活体哺乳动物大脑皮层下深层区域进行高速（Hz级体积速率）、大范围（百微米级体积）、高分辨率（亚细胞水平）的三维动态成像，为神经科学和生物医学研究开辟了新视野。
创新与亮点
01突破核心难题
本研究的首要亮点在于成功突破了活体深组织高速三维动态成像的长期瓶颈。在活体组织中，尤其是哺乳动物大脑内部，强烈的光散射严重限制了光学成像的深度和分辨率；高速成像需求与低光毒性以避免损伤活体样本之间存在矛盾；传统点扫描方式速度慢，难以捕捉快速生理过程。2P-LSM通过融合双光子激发和光片照明，巧妙地解决了这一系列相互制约的难题：近红外双光子激发穿透更深、背景更低；光片照明实现高速面探测；两者结合显著降低了单位像素的光剂量，减轻了光损伤。
将双光子激发与光片照明相结合是本研究的核心技术创新。此前，这两种技术主要独立发展。研究者们解决了关键的技术挑战，如高效生成适用于双光子激发的薄而均匀的近红外光片，设计紧凑的光路实现光片侧向入射与荧光信号垂直收集的几何构型，以及优化系统以匹配高速相机的探测能力。这种融合并非简单叠加，而是创造了一种性能远超各自独立应用的新型成像模态。
03显著性能提升与独特价值
无与伦比的成像深度与分辨率：在活体哺乳动物脑组织中稳定实现600微米以上的高分辨率（亚细胞水平）成像，这是传统光片显微镜难以企及的深度。
革命性的成像速度：体积成像速率达到Hz级别（例如10Hz），比传统点扫描双光子显微镜快数十倍甚至百倍，能够清晰捕捉神经元放电、血流等快速生理事件的三维动态。
极低的光毒性：结合了双光子激发的内在层析性和光片照明的并行照明优势，显著降低了单位体积和单位时间的光剂量，使得长时间、重复的活体观测成为现实，特别适合发育生物学和长期行为研究。
大成像范围：能够一次性对数百微米尺度的组织体积进行成像，提供更全面的组织结构和功能信息，有助于理解细胞群体行为和器官水平的功能整合。
04广泛的应用价值
这项技术的价值远不止于神经科学。它为解决生物医学研究中需要在活体、深层组织内进行高速、高分辨率三维观测的难题提供了通用平台：
神经科学：深入研究皮层下核团（如丘脑、下丘脑、基底节）在感觉处理、运动控制、睡眠觉醒、情绪记忆等高级功能中的作用，解析深部神经回路动态。
血管生物学：在体定量研究深层微循环的血流动力学、血管调节、血管新生以及血脑屏障功能。
免疫学：实时观察免疫细胞（如小胶质细胞、外周浸润免疫细胞）在中枢神经系统深层区域的巡逻、激活和相互作用。
肿瘤研究：监测深层肿瘤微环境中的血管生成、免疫细胞浸润、肿瘤细胞迁移和药物输送过程。
发育生物学：追踪胚胎或器官发育过程中深层组织的细胞行为和组织形态发生。
总结与展望
本研究成功开发并验证了双光子光片显微镜（2P-LSM），这一创新技术将双光子激发的深层穿透、光学层析能力与光片照明的高速、低光毒性优势完美融合，首次实现了在活体哺乳动物大脑皮层下深层区域（>600μm）进行高速（Hz级体积速率）、大范围（百微米级体积）、高分辨率（亚细胞水平）的三维动态成像。该技术突破了传统成像方法在深度、速度和光损伤方面的限制，为清晰揭示活体深部组织（如丘脑、下丘脑）中神经元活动、血管网络动态和免疫细胞行为等关键生理过程提供了前所未有的强大工具，极大地推动了神经科学、血管生物学及相关疾病研究的进展。
展望未来，该技术仍有优化空间，例如通过自适应光学进一步校正组织像差以提升更深层的成像质量，开发多色甚至多光子版本以同时观测更多生物指标，结合行为学装置研究自由活动动物，以及探索在其它器官（如心脏、肾脏、肿瘤）深部成像的应用。随着技术的不断成熟和应用范围的拓展，双光子光片显微镜有望成为生命科学和生物医学研究中不可或缺的利器，持续为理解复杂生命系统的动态奥秘提供关键洞察。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Sundar S, Jin T, Liu YH, Chen Z, Reiss M, Kurnikov A, Subochev P, Razansky D. Integrated two-photon and optoacoustic microscopy for functional neuroimaging. Sci Rep. 2025 Jul 1;15(1):20793.
DOI:10.1038/s41598-025-07819-4.