方案摘要：本方案建立基于Pipetty电动移液器的克罗诺杆菌定量检验方法，以最大可能数（MPN）法为核心，结合选择性增菌、特异性分离及生化鉴定技术实现精准定量。方案核心整合Pipetty电动移液器高精度移液优势，搭配RAYPA培养基自动制备分装仪，优化样品稀释、培养物转移及菌落接种等关键环节，显著降低人为误差。检验流程遵循“BPW前增菌- mLST-Vm选择性富集-显色培养基分离-TSA纯化-生化/PCR确证”标准化步骤，最终依据不同稀释度阳性管数查MPN检索表，报告100g（mL）样品中目标菌MPN值。该方法为食品等领域克罗诺杆菌污染防控提供高效可靠的检验技术支持。
 
方案详情：
一、实验原理
      克罗诺杆菌定量检验基于 MPN（最大可能数）法原理，结合选择性增菌、特异性分离及精准鉴定实现定量。先以 BPW 培养基前增菌，为少量目标菌提供生长环境；再用 mLST-Vm 选择性培养基抑制杂菌、富集目标菌。借助显色培养基分离可疑菌落，挑取后经 TSA 纯化，通过生化反应验证典型特征，可选 PCR 靶向 ITS 区域确认。最终依据不同稀释度阳性管数查 MPN 检索表，报告 100g (mL) 样品中目标菌 MPN 值。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器；
② 恒温培养箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒温水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振荡器；
⑦ 无菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 无菌培养皿:直径90mm；
⑨ pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
⑩ 微生物生化鉴定系统；
⑪ PCR仪；
⑫ 离心机:转速≥12000r/min；
⑬ 凝胶成像系统或紫外检测仪；
⑭ 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪；
⑮ PCR反应管；
⑯ RAYPA培养基自动制备分装仪；
 
2、试剂和材料
① 缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克罗诺杆菌显色培养基；
④ 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鉴定试剂盒；
⑥ 氧化酶试剂；
⑦ L-赖氨酸脱羧酶培养基；
⑧ L-鸟氨酸脱羧酶培养基；
⑨ L-精氨酸双水解酶培养基；
⑩ 糖类发酵培养基；
⑪ 西蒙氏柠檬酸盐培养基；
⑫ 克罗诺杆菌质控菌株；
⑬ 大肠埃希氏菌质控菌株；
 
三、实验步骤
1、取检样 100 g(mL)、10 g(mL)、1 g(mL)各3份,分别置无菌容器中,分别加入 900mL、90mL、9mL已预热至 41 ℃±1 ℃的BPW,用手缓缓地摇动至检样充分溶解,制成1∶10样品匀液,36 ℃±1 ℃培养 18 h±2 h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液,分别移取1mL,转入 10 mL mLST-Vm 肉汤，41.5 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。
2、分离培养
① 提前使用RAYPA培养基自动制备分装仪制备克罗诺杆菌显色培养基平板，设置分装体积20mL/皿，确保培养基厚度4mm±0.2mm，灭菌后冷却至45℃以下，自动分装至培养皿中，凝固后备用。混匀 LST-Vm 肉汤培养物，用 Pipetty 电动移液器精准吸取 10μL培养物。将吸取的培养物分别划线接种于2个克罗诺杆菌显色培养基平板。36℃±1℃培养 24h±2h。
 
② 按显色培养基判定标准挑取可疑菌落，每个平板至少挑 5 个（不足则全挑），用 Pipetty辅助接种，分别划线接种 TSA 平板，36℃±1℃培养 24h±2h 备用。
3、确证实验：将可疑菌落接种 TSA平板后进行生化鉴定。可以首先鉴定克罗诺杆萌显色培养基平板上最具特征性的菌落接种的 TSA 平板上的菌落。如果是阳性,则不需要测试其他TSA 平板上的菌落。如果是阴性,则选取其他 TSA 平板上的菌落进行鉴定,直到全部为阴性或发现阳性菌落为止。为确保结果的准确性,对 TSA 平板上的菌落进行鉴定时,应使用新鲜的传代菌落。克罗诺杆菌的主要生化特征见表3。
 
四、结果报告
综合菌落特征、确证试验(生化鉴定)结果,根据检出克罗诺杆菌的阳性管数,查 MPN检索表,报告 100 g(mL)样品中克罗诺杆菌的 MPN 值。