方案摘要：叶酸是鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值）。利用Pipetty Pro电动移液器的非等量移液功能，可高效完成样本稀释、标液梯度配制及接种等关键液体移取步骤，提升实验操作效率与准确性。
 
 
方案详情：
一、实验原理
叶酸是鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值），在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。
二、实验准备
1、试剂和材料
① 试剂；
② 培养基；
③ 标准品；
④ 标准溶液。
注：本方法所用试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定二级水。
 
2、仪器和设备
① Pipetty Pro电动移液器，MSIC12-01-1000；
② 天平：感量为0.1mg和1mg；
③ 恒温培养箱：36℃±1℃；
④ 高压灭菌锅；
⑤ 涡旋振荡器；
⑥ 离心机:3000r/min；
⑦ 接种环和接种针；
⑧ PH计：精度为±0.1；
⑨ 组织粉碎机和研磨仪；
⑩ 紫外-可见分光光度计或酶标仪；
⑪ 超净工作台；
⑫ 超声波振荡器；
⑬ 13酶标仪；
⑭ 离心管；
⑮ 微孔板（无菌）；
⑯ 滤膜（0.22μ）；
⑰ 容量瓶。
注：所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后，250℃干热1h～2h。
 
三、实验步骤
1、稀释：先将试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜(0.22 μm)过滤除菌,取3支 1.5 ml无菌离心管，使用Pipetty Pro电动移液器非等量分液功能分别加入 100 μL、200 μL、300 μL试样稀释液,补无菌水至 500μL。每个梯度做2个平行。Pipetty PRO的程序储存功能可保存该组稀释参数，后续同批次实验可直接调用，避免重复设置。
 
2、标液稀释：借助Pipetty Pro的非等量移液功能，提前预设好标液移液参数，依次为0.00ｍＬ、0.011ｍＬ、0.022ｍＬ、0.033ｍＬ、0.044ｍＬ、0.056ｍＬ、0.067ｍＬ、0.078ｍＬ、0.089ｍＬ、1.00ｍＬ。将标准系列管依次排列后，使用Pipetty Pro移液器吸取液体，依次向各管加入预设好的叶酸标准工作溶液；随后根据各管已加标液体积计算补水量，重新预设程序，吸取液体，向每管补水至1ｍＬ，完成后用涡旋振荡器混匀。整个过程无需手动频繁调整移液体积，大幅提升梯度配制效率与体积准确性。
 
3、接种和培养：叶酸测定培养基高压灭菌冷却后,每10 mL培养基中加入菌种接种液 40 μL混匀,吸取 150 μL加入微孔板中。另吸取 150 μL,标准系列管或试样系列管加入微孔板中,所有液体添加完成后，用无菌覆膜覆盖微孔板表面，置于涡旋振荡器上轻柔混匀，随后放入36℃±１℃恒温培养箱中培养32ｈ～40ｈ。
4、测定：将培养完成的微孔板取出，轻柔混匀各孔培养物，使用酶标仪在540ｎｍ处测定吸光度值。若0对照孔出现浑浊现象，提示可能存在杂菌污染，需重新进行实验。
四、结果计算
1、以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量（cx），如果３支试样系列管中有２支叶酸 含量在0.10ｎｇ～0.80ｎｇ范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10％，则 可继续按式（1）、式（2）、式（3）进行结果计算，否则需重新取样测定。 试样稀释液的叶酸浓度按式（1）计算。
 
 
 
五、其它
1、一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
2、添加了叶酸的样品，称样量为1.0ｇ，稀释倍数为１时，检出限为0.5μｇ/100ｇ，定量限为1.0μｇ/100ｇ。