Pipetty 电动移液器在牛羊副流感病毒检测中的应用
2025-12-30 来源:广州程淇生物 点击次数:62
方案摘要：本方案针对MDBK 单层细胞制备、病毒接种及培养物传代流程进行优化，通过引入 Pipetty 电动移液器，提升移液操作的精准性、重复性与效率，降低人工误差对实验结果的干扰，尤其适用于病毒滴度检测、临床样品病毒分离等对移液精度要求高的场景
方案详情：
一、实验原理
基于病毒对 MDBK 细胞的特异性感染性，将样品上清或血清接种至敏感 MDBK 单层细胞，在适宜培养条件下，病毒侵入细胞并增殖，引发细胞病变效应。通过盲传3代富集病毒，排除杂菌干扰，结合阳性对照与阴性对照的 CPE 对比，初步筛选病毒阳性样品。后续可通过血清学或分子生物学方法验证病毒种类。实验中精准移液是确保病毒分离效率与鉴定准确性的关键。
二、实验准备
1、试剂和耗材
① 离心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同规格)；
② 10mL一次性移液管；
③ 25cm2细胞培养瓶；
④ 0.5%胰酶消化液；
⑤ 0.45um滤器；
⑥ PBS；
⑦ 细胞培养液与细胞维持液；
⑧ BPIV3或CPIV3毒株；
⑨ MDBK细胞。
2、仪器和设备
① Pipetty Pro电动移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② CO2恒温培养箱；
③ 台式离心机；
④ 高速台式冷冻离心机；
⑤ 旋涡混合振荡器；
⑥ 组织研磨仪；
⑦ 细胞计数仪；
⑧ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同规格)；
⑨ 生物安全柜；
⑩ 倒置显微镜。
三、实验步骤
1、取处于对数生长期的 MDBK 传代细胞，弃去旧培养液，加入适量 0.5% 胰酶消化液，室温消化至细胞变圆脱落。加入细胞培养液终止消化，轻轻吹打瓶壁细胞形成单细胞悬液。
取少量细胞悬液，使用细胞计数仪进行计数。使用Pipetty 电动移液器，精准吸取细胞悬液与培养液，将细胞浓度稀释至 1×10⁵~2×10⁵ 个 /mL。将稀释后的细胞悬液分装至细胞培养瓶，置于 37℃、5%CO₂ 恒温培养箱中静置培养 24h，待细胞形成 90%~95% 致密单层后，备用。
2、每瓶(25cm2)MDBK单层细胞在接毒前，先弃去细胞培养瓶中的培养液，用10mLPBS清洗细胞3次，单次移液模式，加入200μL上清液或血清，再加入细胞维持液5mL;同时，设正常细胞对照1瓶和接种BPIV3或CPIV3阳性对照1瓶(接毒量为105TCID50);37C孵育1h后弃上清，补加细胞维持液5mL/瓶；置于37C、5%CO2。恒温培养箱中培养60h~72h，逐日观察细胞状态，待阳性对照瓶出现100%CPE时，收获细胞培养物。
3、将收获的细胞培养物反复冻融3次，3000r/min离心10min，取上清液，盲传至第3代，逐日观察记录CPE变化。如果正常细胞对照单层完好，形态正常，接种样品的细胞80%以上出现拉网状时，判为典型CPE。将具有典型CPE的细胞培养物反复冻融3次，收获病毒悬液，于-70℃以下冻存备用。
四、结果判定
1、接种样品细胞未出现 CPE，判定为病毒分离鉴定阴性。接种样品细胞出现典型 CPE 时，检测阳性的判定为病毒分离鉴定阳性，检测阴性的判定为病毒分离鉴定阴性。
方案详情：
一、实验原理
基于病毒对 MDBK 细胞的特异性感染性，将样品上清或血清接种至敏感 MDBK 单层细胞，在适宜培养条件下，病毒侵入细胞并增殖，引发细胞病变效应。通过盲传3代富集病毒，排除杂菌干扰，结合阳性对照与阴性对照的 CPE 对比，初步筛选病毒阳性样品。后续可通过血清学或分子生物学方法验证病毒种类。实验中精准移液是确保病毒分离效率与鉴定准确性的关键。
二、实验准备
1、试剂和耗材
① 离心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同规格)；
② 10mL一次性移液管；
③ 25cm2细胞培养瓶；
④ 0.5%胰酶消化液；
⑤ 0.45um滤器；
⑥ PBS；
⑦ 细胞培养液与细胞维持液；
⑧ BPIV3或CPIV3毒株；
⑨ MDBK细胞。
2、仪器和设备
① Pipetty Pro电动移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② CO2恒温培养箱；
③ 台式离心机；
④ 高速台式冷冻离心机；
⑤ 旋涡混合振荡器；
⑥ 组织研磨仪；
⑦ 细胞计数仪；
⑧ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同规格)；
⑨ 生物安全柜；
⑩ 倒置显微镜。
三、实验步骤
1、取处于对数生长期的 MDBK 传代细胞，弃去旧培养液，加入适量 0.5% 胰酶消化液，室温消化至细胞变圆脱落。加入细胞培养液终止消化，轻轻吹打瓶壁细胞形成单细胞悬液。
取少量细胞悬液，使用细胞计数仪进行计数。使用Pipetty 电动移液器，精准吸取细胞悬液与培养液，将细胞浓度稀释至 1×10⁵~2×10⁵ 个 /mL。将稀释后的细胞悬液分装至细胞培养瓶，置于 37℃、5%CO₂ 恒温培养箱中静置培养 24h，待细胞形成 90%~95% 致密单层后，备用。
2、每瓶(25cm2)MDBK单层细胞在接毒前，先弃去细胞培养瓶中的培养液，用10mLPBS清洗细胞3次，单次移液模式，加入200μL上清液或血清，再加入细胞维持液5mL;同时，设正常细胞对照1瓶和接种BPIV3或CPIV3阳性对照1瓶(接毒量为105TCID50);37C孵育1h后弃上清，补加细胞维持液5mL/瓶；置于37C、5%CO2。恒温培养箱中培养60h~72h，逐日观察细胞状态，待阳性对照瓶出现100%CPE时，收获细胞培养物。
3、将收获的细胞培养物反复冻融3次，3000r/min离心10min，取上清液，盲传至第3代，逐日观察记录CPE变化。如果正常细胞对照单层完好，形态正常，接种样品的细胞80%以上出现拉网状时，判为典型CPE。将具有典型CPE的细胞培养物反复冻融3次，收获病毒悬液，于-70℃以下冻存备用。
四、结果判定
1、接种样品细胞未出现 CPE，判定为病毒分离鉴定阴性。接种样品细胞出现典型 CPE 时，检测阳性的判定为病毒分离鉴定阳性，检测阴性的判定为病毒分离鉴定阴性。
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