方案摘要：本方案基于GB/T 40049-2021检测技术要求，深度融合Pipetty电动移液器的高精度、防污染、智能便捷等优势，针对鸡肠炎沙门氏菌PCR检测的关键环节进行优化，显著提升检测结果的重复性、准确性及实验效率，适用于实验室规模化菌株鉴定场景。
 
方案详情：
一、实验原理
该检测基于核酸特异性扩增原理，核心是靶向沙门氏菌保守基因（如 invA、fimY）设计特异性引物。首先提取鸡组织、粪便或饲料样本中的细菌基因组 DNA，随后在 PCR 反应体系中，通过变性、退火、延伸的循环反应，使靶基因片段呈指数级扩增。最终通过凝胶电泳或荧光定量技术检测扩增产物，若出现特异性条带或荧光信号，则判定样本中存在鸡肠炎沙门氏菌，具有快速、特异、灵敏的优势，适用于批量样本的快速筛查。
二、实验准备
1、试剂和材料
   除另有规定外,所用试剂均为分析纯。实验用水均符合GB/T6682-2008二级水规定LB液体培养基。
① 缓冲蛋白胨水(BPW)前增菌液；
② 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液；
③ 四硫磺酸盐煌绿(TTB)增菌液；
④ 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂 ；
⑤ TAE电泳缓冲液；
⑥ 阳性、阴性对照:阳性对照为肠炎沙门氏菌标准株(CVCC3377)培养液,鸡白痢沙门氏；菌标准株(CVCC535)培养液;阴性对照为灭菌超纯水；
⑦ 细菌基因组 DNA 提取试剂盒:商品化试剂盒；
⑧ 无水乙醇:-20 ℃预冷；
⑨ 75% 乙醇:无水乙醇和双蒸水配制,-20 ℃预冷；
⑩ DNA 分子量标记:DNA Marker 2000；
⑪ 琼脂糖；
⑫ 七个持家基因片段的 PCR 引物序列；
⑬ 2×PCR Mix。
 
2、仪器和设备
① Pipetty Pro电动移液器，MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 恒温培养箱(温度范围:5 ℃ ~ 50 ℃,温度均匀度:≤ ±1 ℃)；
③ 高压灭菌锅(灭菌温度:105 ℃~ 135 ℃,工作压力:< 0.35 MPa)；
④ 电子天平(感量 0.001 g)；
⑤ 高速离心机(可控温至4℃、离心速度可达 12000 r/min 以上)；
⑥ 二级生物安全柜；
⑦ 4 ℃冰箱(温控范围2℃~8℃);-20℃冰箱；
⑧ PCR 仪；
⑨ 电泳仪(电压 90 V~ 120 V)；
⑩ 电泳仪(电压 90 V~ 120 V）；
⑪ 控温摇床(温度范围:5 ℃~50 ℃,振荡频率:30 r/min ~ 300 r/min)；
⑫ 凝胶成像仪；
⑬ PCR 反应管；
⑭ 1.5 mL带盖离心管。
 
三、实验步骤
1、将初步鉴定为沙门氏菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组 DNA 提取。提取方法按试剂盒说明书要求进行。
2、设计合成七个持家基因的引物。引物DNA 列参见 B.1。
 
3、用 B.1中所列七对引物对样品基因组 DNA 的七个持家基因分别进行 PCR 扩增。使用Pipetty电动移液器，连续分液模式，设置单次分液体积25μl，完成96孔板的预混液分装，更换吸头，再将引物、模板、无菌水等依次加入。
 
4、PCR反应程序:94 ℃5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃1 min,共 35 个循环;72 ℃7 min;4 ℃保存。
5、使用Pipetty电动移液器，取5μL~ 10 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后,用凝胶成像仪观察结果。
 
6、将七个持家基因均扩增出特异性条带的PCR产物进行测序。
四、结果判定
1、利用 B.1 规定的七对引物,阳性对照菌株 PCR 产物电泳后分别出现七条特异性的扩增条带,阴性对照 PCR 产物无扩增条带,试验结果成立。否则试验不成立。七个持家基因的 PCR 产物电泳图参见图C1。
 
2、 使用 DNA 序列分析软件,将七个持家基因 PCR产物 DNA序列与参考序列分别进行一对一比对。
3、七个基因的测序结果与所对应的参考序列均完全一致，则判断样品为肠炎沙门氏菌阳性