firefly用于构建基于384孔板的3D类器官高通量药物毒理筛选平台
2026-07-07 来源:本站 点击次数:28探索性体外毒理学模型对于优化早期安全性评估至关重要，而传统体系往往缺乏生理相关性。患者源类器官（PDOs）的问世标志着一次重大飞跃，其能够在三维微环境中精准模拟上皮组织生物学中与临床密切相关的关键特征。本研究介绍了利用结直肠患者源类器官构建探索性毒性筛选平台的过程，这些类器官分别来源于肿瘤组织及配对的健康组织。我们建立了一种高通量检测方法，用于评估化合物在富集了干细胞或分化细胞群体的胃肠（GI）类器官及其对应的肿瘤PDOs中所诱导的毒性效应。借助SPT Labtech firefly® 平台，我们开发了一套自动化工作流程，涵盖类器官接种、培养基处理及化合物加样等环节。
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本实验选取 6 种受试药物（阿法替尼、阿达格拉西布、DM4、DXD、吉西他滨、博舒替尼）作用于 11 例患者来源类器官样本（结直肠肿瘤类器官/正常结直肠类器官等），对比分析药物在分化型类器官模型中的毒性响应差异；firefly 完成所有类器官样本的接种。
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每种模型分别采用两种培养基培养：常规培养基与分化培养基。类器官在对应培养体系中培养 120 小时，期间定期更换培养基，以保障其生长与分化。
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化合物处理 72 小时后，使用多聚甲醛（PFA）固定类器官，再通过 Hoechst 染料标记细胞核、Rhodamine Phalloidin 标记 F - 肌动蛋白。采用高内涵成像系统进行 Z 轴层扫成像，定量分析药物处理引发的表型及形态学变化。
图1. 实验流程
图2. firefly 台面布局与 protocol 细节
实验结果
为评估类器官在水凝胶中接种的可靠性，我们进行了测试接种实验，以评价板内及孔间变异性。以 Rhodamine Phalloidin 染色的 F- 肌动蛋白的平均 TRITC 荧光强度作为定量读数，在240个接种孔中观察到的变异系数（CV）为2.46%。顶视图和侧视图结果进一步表明，水凝胶和类器官在每个孔内均分布均匀，证明该体系在 384 孔板中具备优异的接种质量。
样本分布均匀可保证图像分割及后续图像分析结果准确，且分液操作后类器官保持结构完整。以上结果表明，该套实验流程适用于稳定性高的高内涵成像检测，以及重复性良好的化合物剂量反应分析。
图3. 类器官接种稳定性
最后，结合细胞毒性对照组与溶剂对照组，计算各类器官模型在不同培养条件下的 Z' 因子，以此评价实验体系质量。以死细胞占比为检测指标，各组 Z' 因子均稳定高于 0.55，证明该检测体系性能良好，同时印证 firefly 分液结果稳定可靠。
图4. 检测方法质量评估
如图 5 所示，采用分化培养基可成功诱导患者来源类器官（PDO）完成分化。对于正常类器官模型 CR20014D、CR20025D 及 CR20098D，研究将管腔大小作为上皮细胞分化的判定指标，结果显示：相较于常规培养基培养组，分化培养基培养的类器官管腔体积明显缩小。而肿瘤类器官模型 CR20014B、CR20098B 未出现上述分化相关变化；肿瘤模型 CR20025B 在分化培养基培养后，管腔体积反而增大。
本研究以 F - 肌动蛋白总荧光强度表征细胞骨架成熟度。正常类器官 CR20014D、CR20025D、CR20098D 在分化培养条件下，该指标相较于常规培养组显著上升。与之相反，对应的同源肿瘤类器官经分化培养后，肌动蛋白总信号强度出现下降。
图5. PDO分化结果
结论