方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫3ABC-I-ELISA全流程，依托Fluidot自动移液工作站精准移液、微量分液及程序储存等核心优势，对批量加样、梯度稀释、微量试剂添加等关键步骤进行优化。设备具备匀速稳定的吸排液与高精度控量性能，可有效避免手动操作中力度不均、速率不一及手部抖动造成的体积偏差，大幅减轻大批量、长时间实验的人工操作疲劳。显著提升实验检测重复性与孔间均一性，规避人为操作误差，确保实验结果稳定可信，为口蹄疫血清抗体检测、疫病筛查及流行病学监测提供标准化、可追溯的操作方案，有效提升批量检测效率、规范实验操作流程、降低实验系统误差。
 
 
方案详情：
一、实验原理
猪口蹄疫 3ABC-I-ELISA 采用间接 ELISA 原理，以口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC 为包被抗原，特异性识别感染后产生的抗体。待检血清加入后，特异性抗体与固相抗原结合，再加入酶标二抗进行反应。洗涤后加入底物显色，颜色深浅与血清中抗体含量正相关。该方法可区分感染猪与免疫猪，适用于野毒感染筛查、净化评估及流行病学监测，具有特异性强、灵敏度高、适合批量检测的特点。
二、试验设备
1、器材
① Fluidot自动移液工作站及吸头；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
 
2、试剂
① 阴性对照血清；
② 阳性对照血清；
③ 洗涤缓冲液；
④ 25倍浓缩 PBS缓冲液；
⑤ 兔抗牛、羊或猪IgG-HRP酶结合物，使用时用血清稀释液稀释至工作浓度。
⑥ 血清稀释液；
⑦ TMB底物溶液；
⑧ 终止液:0.3mol/L硫酸；
⑨ 纯化的3ABC蛋白。
 
三、实验步骤
1、提前调试Fluidot自动移液工作站移液程序，在血清稀释板每孔精准加入120μL血清稀释液；并依次向对应孔位加入阳性对照血清、阴性对照血清及待检血清，每孔加样量6μL，实现1:21倍血清稀释。其中标准阴、阳性对照血清均平行加两孔，待测血清单孔加样，预留两孔空白孔不添加血清作为空白对照。震荡混匀后，随后通过Fluidot自动移液工作站将稀释完成的血清对应转移至包被3ABC抗原的ELISA反应板中，每孔转移100μL。加样结束后用封口膜密封酶标板，置于37℃恒温环境中结合反应30min。全程设备每次操作均自动丢弃旧吸头，取用新吸头。
 
2、取出酶标板，小心去除封口膜，每孔加满洗涤缓冲液，重复洗涤5次，最后一次洗涤后充分拍干孔内残留液体，避免残留洗液影响后续反应。
3、提前配置好工作浓度的兔抗猪IgG-HRP酶结合物，通过Fluidot自动移液工作站统一分液，每孔精准加入100μL酶结合物溶液，加样完成后用封口膜封板，置于37℃恒温环境中孵育结合30min。
4、孵育结束后去除封口膜，每孔加满洗涤缓冲液洗涤5次，最后一次充分拍干孔内残留洗液，保证孔内无杂质残留。
5、通过Fluidot自动移液工作站，向每孔精准加入100μL TMB底物溶液，加样完成后用封口膜避光密封酶标板，置于37℃环境中避光显色10min~15min。显色期间实时监测OD_630nm数值，待数值接近0.7时及时终止反应，保证显色效果最佳。
6、通过Fluidot自动移液工作站统一加入100μL 0.3mol/L硫酸终止液终止显色反应，全程分液匀速等量、无孔间误差，试验有效标准为终止后阳性对照孔OD450nm值小于2.1。
 
7、轻轻摇振混匀，测定波长450nm吸光值15.3.7
 
四、试验成立条件
阳性对照平均OD_450nm值应大于0.6;阴性对照平均OD_450nm值应小于0.2。
四、结果判定

1. 样品效价=(ODOD_450nm样品一ODOD_450nm阴性对照)÷(ODOD_450nm阳性对照一ODOD_450nm阴性对照)。
2. 被检血清样品效价小于0.2,判为阴性。被检血清样品效价大于或等于0.3.判为阳性。被检血清样品效价介于0.2~0.3之间为可疑;可疑样品复测效价大于或等于0.2,则判定为阳性。