方案摘要：荧光 PCR 技术，是基于聚合酶链式反应（PCR）技术结合荧光探针实时监测，实现对病毒核酸（DNA）进行高灵敏、高特异、可定量检测的分子生物学方法，广泛应用于临床快速诊断、流行病学调查及疫苗效果评估等场景。为提升实验效率，本方案使用了Pipetty电动移液器，通过其自动混匀和连续分液功能，提高上样效率，并且由于其体积小，重量轻，在提高效率的同时，还能减少操作者的手部疲劳。
 
方案详情：
一、实验原理
      犬细小病毒（CPV）荧光 PCR 实验基于实时荧光定量 PCR（qPCR）技术，核心是通过特异性核酸扩增与荧光信号实时监测实现病毒检测。实验针对 CPV 高度保守的 VP2 基因设计特异性引物与 TaqMan 荧光探针 —— 探针两端分别标记荧光报告基团与淬灭基团，未反应时淬灭基团抑制荧光信号。PCR 反应中，Taq 酶延伸引物时，其 5'→3' 外切酶活性水解结合靶序列的探针，使两基团分离，释放荧光。荧光信号强度与 PCR 产物量（即初始 CPV DNA 量）正相关，通过仪器实时采集信号，以荧光达到阈值的循环数（Ct 值）及 “S 型” 扩增曲线判读结果，兼具高灵敏度、高特异性与定量能力。
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；
② 冰箱(4℃、-20 ℃、-70 ℃)；
③ 荧光 PCR 仪；
④ 高速冷冻离心机(4℃、离心速度12000r/min 以上)；
⑤ 无DNA酶离心管与带滤芯吸头。
 
2、试剂和材料
① DEPC水(0.1%)；
② Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)；
③ 反应缓冲液；
④ MgCl₂ ；
⑤ dNTP Mix；
⑥ Taq 酶。
⑦ 上游引物(PrimerF):5'-GACAATCTTGCACCAATGAG-3'；
下游引物(PrimerR):5'-CCAGATCCTGTAGCTCTTTC-3'；
Primer P:5'-(FAM)TGGAGCAGTTCAACCAGACGG(BHQ1)-3'。
 
 
三、实验步骤
1、用DEPC水作为CPV阴性对照，用CPV的细胞培养物作为CPV阳性对照，无酶水作为空白对照。
2、使用Pipetty电动移液器，取处理好的待检样品上清液500μL置于1.5mL无DNA酶离心管中，加入500μL DNAiso Reagent 试剂，颠倒混匀6次~8次，静置约10 min后，12 000 r/min 离心 10 min。
 
3、取上清液(至少500 μL)至新的 1.5 ml无 DNA酶离心管中，每管加入 400 μL无水乙醇，颠倒混匀6次~8次，4000r/min离心2min。
4、 小心弃掉上清液，加1mL 75%(体积分数)乙醇溶液，颠倒混匀6次~8次，12000 r/min离心5 min。
5、小心弃掉上清液，倒置在干净的吸水纸上晾干水分，加入20μL DEPC水溶解DNA沉淀。-20℃冰箱中保存备用。
注：可以使用等效的商品化试剂盒进行DNA提取。
6、使用Pipetty电动移液器，根据表2的荧光PCR反应体系，设置单次分液模式，将除DNA模板之外的试剂按照所需孔数计算体积并×10%，移取至离心管中，混匀模式，自动混匀。 
7、设置连续分液模式，将混合好的试剂和DNA模板分别加入到96孔板中，离心。
 
8、将PCR管置荧光 PCR仪上按如下程序扩增：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，40个循环。每个循环60℃收集FAM 荧光。
 
 
四、结果判定
1、试验成立条件
a) 阴性对照无Ct值或C≥40,且无特定的S型扩增曲线;
b) 阳性对照的Ct＜35,且出现特定的S型扩增曲线;
c) 阴性对照和阳性对照同时满足以上条件可判定试验有效,否则试验无效;
2、 结果描述及判定
a） 无Ct值或Ct≥40,目无特定的S型扩增曲线,判为CPV核酸阴性。
b)  Ct≤38,且出现特定的S型扩增曲线,判为CPV核酸阳性,扩增曲线图见附录D。
c)  38＜Ct＜40且出现特定的S型扩增曲线,判为可疑。在排除样本或产物污染的可能性后,重新提取核酸检测,无 Ct值或 Ct≥40且无特定的S型扩增曲线,判为 CPV 核酸阴性,Ct＜40且出现特定的S型扩增曲线,判为CPV核酸阳性。