方案摘要：PCR 检测是犬细小病毒诊断的 “金标准”，其高敏感性、高特异性可实现早期精准诊断。在实际应用中，需严格把控样本采集、处理及污染控制环节，并结合狗狗的年龄、临床症状（如体温、粪便性状）综合判断，才能为治疗方案制定（如补液、抗病毒、对症支持）提供可靠依据，降低 CPV 的死亡率。当前实验室移液操作中，人工移液存在精度波动大、批量处理效率低、交叉污染风险高的痛点，尤其在犬细小病毒 PCR 检测等对移液精准度要求严苛的场景中，人工操作易因误差导致试剂浪费、检测结果重复性差，甚至因污染引发假阳性 / 假阴性，影响诊断准确性。使用 Pipetty电动移液器，可针对性解决上述问题，提升移液环节的标准化与可靠性。
 
方案详情：
一、实验原理
      犬细小病毒（CPV）PCR 检测以病毒VP2 基因为核心靶点（该基因高度保守、无交叉同源性，确保特异性），通过体外三步温度循环实现 CPV DNA 指数级扩增。首先 90-95℃变性，使 CPV 双链 DNA 解旋为单链；随后 50-65℃退火，让特异性引物结合单链 VP2 基因靶点；再于 72℃延伸，Taq 酶以 dNTP 为原料合成新链，每轮循环使病毒 DNA 量翻倍，30-40 轮后可扩增至可检出水平，普通PCR通过琼脂糖凝胶电泳观察特定条带判读。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)；
③ PCR 仪；
④ 高速冷冻离心机(4℃、离心速度12000r/min以上)；
⑤ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像系统；
⑦ 无DNA酶离心管与带滤芯吸头。
 
2、试剂和材料
① DNA isoReagent 试剂:DNA提取试剂，也可用商品化DNA提取试剂盒，或其他等效 DNA 提取试剂和方法，如自动化核酸提取仪和其他配套核酸抽提试剂进行核酸提取；
② 无水乙醇；
③ DEPC水(0.1%)；
④ PCR相关试剂:可选择商品化试剂盒，操作步骤按照说明书进行；
⑤ Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/μL，-20℃保存；
⑥ dNTP:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10 mmol/L，-20 ℃保存；
⑦ 5×TBE电泳缓冲液。
⑧ 引物浓度:20 mol/,其序列如下：
上游引物(CPVF):5'GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC-3'；
下游引物(CPVR):5'GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C-3'；
 
 
三、实验步骤
1、用DEPC水作为CPV阴性对照，用CPV的细胞培养物作为CPV阳性对照，无酶水作为空白对照。
2、使用Pipetty电动移液器，取处理好的待检样品上清液500μL置于1.5mL无DNA酶离心管中，加入500μL DNAiso Reagent 试剂，颠倒混匀6次~8次，静置约10 min后，12 000 r/min 离心 10 min。
 
3、取上清液(至少500 μL)至新的 1.5 ml无 DNA酶离心管中，每管加入 400 μL无水乙醇，颠倒混匀6次~8次，4000r/min离心2min。
4、 小心弃掉上清液，加1mL 75%(体积分数)乙醇溶液，颠倒混匀6次~8次，12000 r/min离心5 min。
5、小心弃掉上清液，倒置在干净的吸水纸上晾干水分，加入20μL DEPC水溶解DNA沉淀。-20℃冰箱中保存备用。
注：可以使用等效的商品化试剂盒进行DNA提取。
6、使用Pipetty电动移液器，根据表1的PCR反应体系，设置单次分液模式，将除DNA模板之外的试剂按照所需孔数计算体积并×10%，移取至1.5ML离心管中，混匀模式，自动混匀。 
7、设置连续分液模式，将混合好的试剂和DNA模板分别加入到96孔板中，离心。 
8、将 PCR管置 PCR仪上按如下程序扩增:94℃预变性2min；94℃变性30s，55 ℃退火 30s，72 ℃延伸40s，进行35个循环；72 ℃延伸3 min。
9、用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板，将凝胶平板放入水平电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面，使用Pipetty，将10μL PCR产物和2μL加样缓冲液(6X)，混匀后加入样品孔。
10、电泳时应设立DNA分子质量标准对照。
11、在120V、90mA条件下电泳约30min，电泳结束后，用凝胶成像系统观察结果
四、结果判定
1、CPV阳性对照样品扩增出大小为559bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，判定阴、阳性对照成立；否则试验结果无效。
2、在阴、阳性对照成立条件下，若待检样品扩增出大小为559bp的核酸片段，判为CPV核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为559bp，判为CPV核酸阴性。