方案摘要：本方案以 Pipetty 电动移液器为核心移液工具，优化狂犬病毒实时荧光 RT-PCR 检测流程。其 75g 超轻机身适配笔式操作，便于在 RNA 提取时精准移取 0.1-20μL 微量洗脱液，提升核酸回收率。在 RT-PCR 体系配制环节，依托其高精度连续分液功能，可快速等量分配引物、探针等试剂，操作效率较手动提升 50% 以上。更通过专利温度控制技术，实时补偿手热导致的移液偏差，避免体系误差影响 Ct 值判读。适配多品牌吸头的特性可降低耗材费用，并全程减少人为操作差异，为病毒检测的高敏感性与特异性提供可靠支撑。
  
方案详情：
一、实验原理
       狂犬病毒为单链负链 RNA 病毒，无法直接用 PCR 扩增，故需先经逆转录（RT）步骤：以病毒 RNA 为模板，在逆转录酶作用下合成可扩增的互补 DNA（cDNA）。后续通过实时荧光定量 PCR实现检测：向反应体系中加入针对狂犬病毒保守基因（如核蛋白 N 基因，序列稳定、特异性高）的引物与荧光探针。PCR 循环中，引物特异性结合 cDNA 并引导其扩增，同时荧光探针随扩增被水解，释放荧光信号。仪器实时监测荧光强度，当信号达到设定阈值时，记录对应的循环数（Ct 值）。通常 Ct 值＜临界值（如 37）且荧光曲线呈 “S” 型为阳性（提示存在病毒 RNA），Ct 值≥临界值或无荧光信号为阴性，以此实现病毒的快速、敏感检测。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型台式冷冻离心机；
④ 荧光定量PCR 仪；
 
2、试剂和材料
① 狂大病病毒阳性对照脑组织；
② 狂大病病毒阴性对照脑组织；
③ 特异性扩增引物和探针：
上游引物F:5’-CCCTACAATGGATGCCGAC;
下游引物R:5’-AGCTTGGCAGCATTCATRCC;
荧光探针P:FAM-AGTCAATAATCAGGTGGTCTC-TAMRA。
④ RNA 提取试剂盒或试剂(商品化试剂)；
⑤ 一步法实时荧光RT-PCR 试剂盒或相应酶类及缓冲液(商品化试剂,包括反转录酶、DNA 聚合酶dNTP、反应缓冲液、无 RNA 酶水等）；
 
 
三、实验步骤
1、分别从不同部位待检脑组织(至少应包含脑干及小脑组织)各取样品约1g，样品量少时可取全部组织。剪碎混匀,取其中约1g置组织匀浆器中,加入1mL生理盐水进行匀浆,以3000g离心2min 后取 100μL,匀浆上清于 1.5 mL灭菌离心管中。使用Pipetty电动移液器，将狂犬病病毒阳性和阴性对照脑组织各取 100μL分别置于 1.5 mL 灭菌离心管中。唾液样品直接取 100μL, 置于 1.5 mL灭菌离心管中。
 
2、使用Pipetty电动移液器，使用 RNA 提取试剂盒,按试剂盒说明书提取待检样品和对照样品总 RNA。
3、用无 RNA 酶水将引物溶解或稀释至浓度 10 μmol/L。
4、使用一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒,按说明书配制 50 μL,反应体系,设置Pipetty电动移液器的连续分液程序，精准加入经稀释的上游引物 F、下游引物 R各 1.5 μL,探针P 1μL,提取的样品总 RNA 5μL,混匀后瞬时离心,置荧光定量 PCR 仪内进行扩增。
 
5、45 ℃反转录 20 min;95 ℃预变性2 min;95 ℃变性 15 s,56 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 20 s,或95 ℃变性 15 s,60 ℃退火和延伸 30 s,40 个扩增循环。设定于延伸反应末收集 FAM 荧光信号。
 
 
四、结果判定
1、狂犬病病毒阳性对照样品 Ct<33、阴性对照样品无 Ct或 Ct>37 时,检测有效。
2、待检样品 Ct≤33 时,判定为狂犬病病毒核酸阳性;无 Ct或 Ct>37 时,判定为狂犬病病毒核酸阴性。
3、待检样品 33