方案摘要：本方案采用巢式逆转录 PCR（巢式 RT-PCR）技术，实现对狂犬病毒的高敏感、高特异检测。适用于人类生前筛查（唾液、脑脊液等）及死后确诊（脑组织），亦用于动物狂犬病溯源。结合 Pipetty 电动移液器操作，其精准的移液精度可减少 RNA 提取及 PCR 体系配制中的人为误差，稳定的移液速度避免样本飞溅导致的交叉污染，提升批量样本处理的一致性与效率。该方案结合电动移液器优势，可高效支持狂犬病确诊、动物溯源，为防控提供可靠依据。
 
方案详情：
一、实验原理
       狂犬病毒为单链负链 RNA 病毒，无法直接用常规 PCR 扩增，故采用巢式 RT-PCR 检测，核心是 “逆转录 + 两轮递进扩增”。首先通过逆转录酶将病毒 RNA 转化为可扩增的 cDNA；接着第一轮 PCR 用外引物（针对病毒保守基因如 N 基因）扩增 cDNA，得到初步产物；再取少量首轮产物，用结合于首轮产物内部的内引物进行第二轮 PCR。两轮扩增使目标片段放大 10⁴-10⁶倍，大幅提升敏感性（可检出低至 10 拷贝 /mL 的病毒 RNA），且内引物仅扩特异片段，彻底排除非特异扩增，显著提高检测特异性，适配生前低载量样本（如唾液）及死后样本的狂犬病毒检测。
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型台式冷冻离心机；
④ PCR 仪；
⑤ 水平电泳仪；
⑥ 凝胶成像仪；
⑦ 组织匀浆器等。
 
2、试剂和材料
① 狂大病病毒阳性对照脑组织；
② 狂大病病毒阴性对照脑组织；
③  特异性扩增引物：
外套上游引物F1:5-GTGTAACACCTCTACAATGG；
外套下游引物R1:5-ACAGTCTCYTCNGCCATCT；
内套上游引物F2:5-CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG；
内套下游引物R2:5-AGCCCTGGTTCGAACATTCT。
④ RNA 提取试剂盒或试剂(商品化试剂)；
⑤ 一步法 RT-PCR 试剂盒或相应酶类及缓冲液(商品化试剂),包括反转录酶、DNA 聚合酶dNTP、反应缓冲液、无 RNA 酶水等；
⑥ PCR试剂盒或相应酶类及缓冲液(商品化试剂),包括 DNA 聚合酶、dNTP、反应缓冲液、无RNA 酶水等；
⑦ TAE 电泳及制胶缓冲液。
 
 
三、实验步骤
1、分别从不同部位待检脑组织(至少应包含脑干及小脑组织)各取样品约1g，样品量少时可取全部组织。剪碎混匀,取其中约1g置组织匀浆器中,加入1mL生理盐水进行匀浆,以3000g离心2min 后取 100μL,匀浆上清于 1.5 mL灭菌离心管中。使用Pipetty电动移液器，狂犬病病毒阳性和阴性对照脑组织各取 100μL分别置于 1.5 mL 灭菌离心管中。唾液样品直接取 100μL, 置于 1.5 mL灭菌离心管中。
 
2、使用Pipetty电动移液器，使用 RNA 提取试剂盒,按试剂盒说明书提取待检样品和对照样品总 RNA。
3、用无 RNA 酶水将引物溶解或稀释至浓度 10 μmol/L。
4、PCR 扩增
a）外套扩增：使用一步法 RT-PCR 试剂盒,按说明书配制反应体系,进行扩增条件设置。50 ℃反转录 30 min;95 ℃预变性 2 min; 95 ℃变性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 90 s,30 个循环;72 ℃终延伸 5 min。
b)内套扩增：使用 PCR 试剂盒,以外套扩增产物1μL为模板,使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，按说明书配制反应体系,进行扩增条件设置。95 ℃预变性2min；95 ℃变性 30 s,55 ℃退火 30s,72 ℃延伸 30 s,30 个循环；72 ℃终延伸5 min。
 
c) 扩增产物电泳：取内套扩增产物5 μL~10 μL,加样于含核酸染色剂的 1.0%琼脂糖凝胶孔中,另孔加5 μL DNA Marker,以 100 V~120 V电压于 1×TAE 电泳缓冲液中电泳约20 min,于凝胶成像仪内观察结果。
 
 
四、结果判定
1、狂犬病病毒阳性对照样品出现 255 bp 扩增条带、阴性对照样品无特异扩增条带时,检测结果成立。
2、被检样品出现 255 bp扩增条带时判定为狂犬病病毒核酸阳性,否则判定为阴性。