方案摘要：狂犬病毒检测中的RT-RPA 技术，全称为逆转录重组酶聚合酶扩增技术（Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification），是一种针对狂犬病毒（RNA 病毒）的快速、灵敏的分子检测方法，核心用于体外检测样本中狂犬病毒的 RNA，广泛应用于动物检疫、疑似病例筛查等场景。本方案使用了Pipetty电动移液器，其 75g 超轻笔式设计降低手部负担，减少肌腱炎风险，握笔式操作适配狭小加样空间。连续分液功能使操作时间缩短 1/2-2/3，单枪可实现 10μL 液量 25 次重复分配，大幅提升微孔板加样效率，为实验标准化提供关键支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
       狂犬病毒检测（RT-RPA）核心是逆转录与重组酶介导等温扩增的协同作用，针对狂犬病毒（单链 RNA 病毒）特性，分两步实现病毒 RNA 的高效检测。第一步为逆转录反应：样本中提取的狂犬病毒 RNA，在逆转录酶催化下，以 RNA 为模板合成互补 DNA（cDNA），解决 RNA 无法直接被 DNA 聚合酶扩增的问题，为后续扩增提供底物。第二步为等温扩增反应：在 37-42℃恒温条件下，重组酶与特异性引物结合形成复合物，快速扫描 cDNA 并定位匹配序列；单链结合蛋白（SSB）随即结合解开的 DNA 单链，防止其复性；DNA 聚合酶沿引物 3' 端延伸，实现 cDNA 指数级扩增。同时，反应体系中的荧光探针或标记引物随扩增释放信号，最终通过荧光强度或试纸条条带，判定样本中是否存在狂犬病毒 RNA。
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型台式冷冻离心机；
④ 荧光PCR 仪；
 
2、试剂和材料
① 狂大病病毒阳性对照脑组织；
② 狂大病病毒阴性对照脑组织；
③ 特异性引物和探针。
引物 RPA-F:5'-ATGGATGCCGACAAGATTGTMTTYAAAGTYAATAATCA。
引物RPA-R:5'-CTGGTCCAGTCYTCMGGRCATGTYCCCTCAAA.
探针RPA-P:5'-TCAAATCTTTGATAGCAGGGTACTTGTACTCA(FAM-dT)AT(THF)
GA(BHQ-dT)CCACGATAATC-*。其中*代表阻止引物延伸的基团,可采用磷酸化或者 C3spacer修饰实现。
④ RNA 提取试剂盒(商品化试剂)。
⑤ 反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)试剂盒(商品化试剂)。
 
三、实验步骤
1、分别从不同部位待检脑组织(至少应包含脑干及小脑组织)各取样品约1g，样品量少时可取全部组织。剪碎混匀,取其中约1g置组织匀浆器中,加入1mL生理盐水进行匀浆,以3000g离心2min 后取 100μL,匀浆上清于 1.5 mL灭菌离心管中。使用Pipetty电动移液器，狂犬病病毒阳性和阴性对照脑组织各取 100μL分别置于 1.5 mL 灭菌离心管中。唾液样品直接取 100μL, 置于 1.5 mL灭菌离心管中。
 
2、使用Pipetty电动移液器，使用 RNA 提取试剂盒,按试剂盒说明书提取待检样品和对照样品总 RNA。
3、用无 RNA 酶水将引物溶解或稀释至浓度 10 μmol/L。
4、使用反转录-重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)试剂盒,按说明书配制 50 μL反应体系,设置连续分液模式，加入经稀释的引物 RPA-F、RPA-R 各 2.1 μL,探针 RPA-P 0.6 μL,总 RNA 模板2μL,混匀后加入混合酶反应管(试剂盒组分),最后加入 280 mmol/L,醋酸镁(试剂盒组分)2.5μL。同时设置狂犬病病毒阳性对照样品、阴性对照样品和反应体系空白对照(不加模板 RNA)。
 
4、配制好的反应体系应立即上机扩增。使用荧光定量 PCR 仪时,设置 39 ℃扩增 30s,45 个循环,于反应全程收集 FAM 荧光信号;使用等温扩增检测仪时,39 ℃扩增5 min后,取出反应管颠倒混匀,短时离心后再以 39 ℃继续扩增 17.5 min,在 17.5 min 反应全程收集 FAM 荧光信号。
 
四、结果判定
1、狂犬病病毒阴性对照样品无荧光曲线或 Ct>42,阳性对照样品 Ct≤30,反应体系空白对照无荧光曲线时判定检测反应成立。
2、待测样品 Ct≤37 时判定为狂犬病病毒核酸阳性;无荧光曲线或 Ct>42 时判定为狂犬病病毒核酸阴性;37