方案摘要：肝素生物测定中的抗 Ⅱa 因子测定法，是基于肝素对凝血因子 Ⅱa（即凝血酶）的特异性抑制作用，定量检测肝素（尤其是普通肝素、低分子肝素）生物活性的关键方法，其核心优势是直接反映肝素的抗凝生物效应（而非单纯化学含量），是临床监测和药品质量控制的重要手段。为提升试验效率，本方案采用了Pipetty电动移液器，核心优势集中于提升操作精度与效率、降低人为误差，精准度高，通过电动驱动系统实现 0.1μL 级增量调节，避免手动按压力度不均导致的移液偏差；支持连续分液模式，批量处理 96 孔板等样本时效率较手动提升 3 倍以上；机身体积小重量轻，可降低长时间操作疲劳感，同时兼容多种规格吸头，适配不同实验试剂需求，全方位保障实验结果可靠性与操作便捷性。
 
方案详情：
一、实验原理
       该方法核心是基于肝素对凝血因子 Ⅱa（凝血酶）的间接抑制作用定量其生物活性。肝素本身无直接抑酶活性，需先与血浆中抗凝血酶（AT）结合，诱导 AT 构象改变并激活，形成的 “肝素 - AT 复合物” 对 Ⅱa 因子亲和力显著提升，可快速结合 Ⅱa 因子形成三元复合物，使其失去催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白的凝血功能。实验中加入已知量的 AT 和 Ⅱa 因子，肝素浓度越高，被抑制的 Ⅱa 因子越多，剩余 Ⅱa 活性越低。通过加入特异性发色底物，剩余 Ⅱa 因子可水解底物产生有色产物，其吸光度与剩余 Ⅱa 活性正相关。借助肝素标准品绘制 “吸光度 - 浓度” 标准曲线，即可反推出待检样本中肝素的生物活性浓度，直接反映其抗凝效应。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；
② 恒温水浴箱 37℃±0.5℃；
③ 酶标仪；
④ 离心管、96 孔酶标板（平底，透明）；
⑤ 涡旋振荡器。
 
2、试剂和材料
① 三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液；
② 抗凝血酶溶液；
③ 凝血酶溶液；
④ 发色底物溶液；
⑤ 肝素标准品；
⑥ 供试品。
 
 
三、实验步骤
1、制备供试品溶液与稀释液：按供试品的标示量或估计效价（AT），用三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4），制成4个不同浓度的溶液，相邻两浓度之比值（r）应与标准品相等，供试品与标准品各剂量组的反应值应相近。
2、取不同浓度的标准品（S）系列溶液或供试品（T）系列溶液及上述缓冲液（B），按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序，试用Pipetty电动 移液器，设置连续分液模式，依次向酶标板各孔中分别加入20μL的上述溶液,每个浓度做三个复孔；
 
3、使用连续分液模式，每孔加入20μL的抗凝血酶溶液，混匀模式，自动混匀，37℃平衡2分钟；
4、再加入凝血酶溶液20μL，自动混匀，37℃平衡2分钟；
5、再加入发色底物溶液20μL，自动混匀，37℃准确保温2分钟后，再精密加入50%醋酸溶液20μL，终止反应后，迅速冷却至室温。
四、结果判定
1、用酶标仪在405nm的波长处测定各孔的吸光度。B1、B2两孔的吸光度不得有显著性差异。以吸光度为纵坐标，标准品系列溶液（或供试品系列溶液）浓度的对数值为横坐标分别作线性回归，按生物检定统计法（通则1431）中的量反应平行线原理4.4法实验设计，计算效价及实验误差。
2、本法的可信限率（FL%）不得大于10%。