方案摘要：本方案围绕单核细胞增生李斯特氏菌检测流程，以 RAYPA 培养基自动制备分装仪为核心优化载体，重构检测全流程。核心聚焦培养基制备分装环节，通过仪器实现原料溶解、灭菌、降温、分装一体化操作，以参数精准控制、全封闭无菌流程、批量高效制备，保障培养基质量一致性与无菌性。依托仪器制备的标准化平板，减少人工误差。整体流程通过仪器赋能，实现降本增效、数据精准可靠，适配高通量检测需求，显著提升检测流程的规范性与结果可信度。
 
方案详情：
一、实验原理
      本试验基于单核细胞增生李斯特氏菌的生理特性与特异性培养基显色反应实现检测。采用 OA 李斯特氏菌显色培养基（或等效培养基），其含目标菌特异性代谢底物，该菌生长代谢时可分解底物产生特征显色菌落，实现与其他菌的初步区分。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① RAYPA培养基自动制备分装仪；
② Pipetty Pro 非等量电动移液器MSIC12-01-1000；
③ 恒温培养箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均质器。
⑤ 显微镜:100 x~1 000 x。
⑥ 电子天平:感量为 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 锥形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 无菌培养皿:直径 90 mm。
⑨ 无菌试管:16 mm x 160 mm。
⑩ 离心机:4 000 r/min。
⑪ 无菌离心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 无菌涂布棒。
⑬ 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,体重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鉴定系统及无菌过滤装置。
 
2、试剂和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉汤(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌显色培养基；
⑤ PALCAM 培养基；
⑥ 革兰氏染色液；
⑦ SIM 动力培养基；
⑧ 缓冲葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血琼脂；
⑩ 无菌磷酸盐缓冲液；
⑪ 无菌生理盐水；
⑫ 糖发酵管；
⑬ 过氧化氢试剂；
⑭ 微生物生化鉴定试剂盒。
 
三、实验步骤
1、提前启动RAYPA培养基自动制备分装仪，将试验所需的培养基，肉汤，蛋白胨水制备并精准分装保存至玻璃瓶或无菌培养皿内。
 
2、根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度分别吸取 0.1mL样品匀液,接种1个OA李斯特氏菌显色培养基平板。并用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在 25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。
注:必要时,每个稀释度可做重复试验。
3、对于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低的食品样品,使用Pipetty Pro 非等量电动移液器，预设好单次分液量后，一次性吸取1mL最低稀释度样品匀液,以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接种量分别涂布于3块 OA李斯特氏菌显色培养基平板。
注：从样品稀释至样品接种完毕不得超过 45 min。
 
4、涂布后,将平板正置于水平桌上 10 min~20 min后翻转平皿,放入培养箱培养,36 ℃±1℃ 培养 24 h~48 h。
5、如果样液不易吸收,可将平板正置在培养箱 36 ℃±1 ℃培养1h,等样品匀液吸收后再翻转平皿,倒置于培养箱,36 ℃±1 ℃继续培养 24 h~48 h。
6、选择有典型或可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落生长的平板,如果:
a) 只有1个稀释度的平板合计典型或可疑菌落数在 15 CFU~150 CFU之间,应计数该稀释度平板上的典型或可疑菌落数;
b) 所有稀释度的平板合计典型或可疑菌落数均小于15 CFU,应计数最低稀释度平板上的典型或可疑菌落数;
c) 所有稀释度的平板合计典型或可疑菌落数大于150 CFU,应计数最高稀释度平板上的典型或。可疑菌落数;
d) 所有稀释度的合计平板典型或可疑菌落数均不在 15 CFU~150 CFU 之间,其中一部分小于15 CFU 或大于 150 CFU 时,应计数最接近 15 CFU 或 150 CFU的稀释度平板上的典型或可疑菌落数;符合 a)~d)者按式(1)计算。
 
e) 2个连续稀释度的合计平板典型或可疑菌落数均在 15 CFU~150 CFU 之间,按式(2)计算。
 
6、从每个平板中挑取5个典型或可疑菌落(少于5个全选),进行鉴定。
 
四、结果报告
1、菌落数小于 100 CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
2、菌落数大于或等于 100 CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前两位数字,后面用0代替位数。也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。
3、 报告每g(mL)样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数,以 CFU/g(mL)表示;如T值为 0,接种量采用 0.1 mL,方法的以小于 10 乘以最低稀释倍数报告。接种量采用 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL方法的以小于1乘以最低稀释倍数报告。