方案摘要：方案针对单核细胞增生李斯特氏菌检测，整合 RAYPA 培养基自动制备分装仪核心优势，优化检测全流程。仪器实现培养基溶解、灭菌、恒温搅拌、精准分装一体化操作，可自动完成 FB 增菌肉汤、OA 显色培养基等多类培养基制备，控温精准、分装误差小，保障培养基成分均一性。同时，减少手动操作带来的污染风险与人为误差，批量制备效率提升 40% 以上。流程以自动化培养基制备为基础，衔接样品增菌、分离培养、生化鉴定等环节，既符合 GB 4789.30-2025 标准要求，又适配规模化检测需求，实现检测高效性与结果可靠性的双重保障。
 
方案详情：
一、实验原理
      通过增菌培养富集目标菌，利用选择性培养基分离单菌落，结合形态特征、生化反应及溶血特性等进行综合鉴定，最终确认是否存在单核细胞增生李斯特氏菌。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① RAYPA培养基自动制备分装仪；
② 冰箱；
③ 恒温培养箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均质器。
⑤ 显微镜:100 x~1 000 x。
⑥ 电子天平:感量为 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 锥形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 无菌培养皿:直径 90 mm。
⑨ 无菌试管:16 mm x 160 mm。
⑩ 离心机:4 000 r/min。
⑪ 无菌离心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 无菌涂布棒。
⑬ 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英诺克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 马红球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,体重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鉴定系统及无菌过滤装置。
 
2、试剂和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉汤(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌显色培养基；
⑤ PALCAM 培养基；
⑥ 革兰氏染色液；
⑦ SIM 动力培养基；
⑧ 缓冲葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血琼脂；
⑩ 无菌磷酸盐缓冲液；
⑪ 无菌生理盐水；
⑫ 糖发酵管；
⑬ 过氧化氢试剂；
⑭ 微生物生化鉴定试剂盒。
 
三、实验步骤
1、使用RAYPA培养基自动制备分装仪，提前制备试验所需的各类培养基并分装至无菌培养皿，静置凝固备用。
 
2、以无菌操作取 25 g(mL)样品,置于盛有 225 mL FB,增菌肉汤的无菌均质杯内,8000 r/min~10 000 r/min 均质1 min~2 min,或放入盛有 225 mL FB,增菌肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min,制成1:10 的样品匀液。若样品为液态,也可采用振荡或搅拌混匀。于 30 ℃±1℃培养 24 h±2 h。使用Pipetty电动移液器，混匀,吸取 0.1 mL FB,增菌肉汤,转种于 10 mL FB,增菌肉汤内。于 30 ℃±1℃培养24 h±2 h。
3、取混匀后的 FB,增菌肉汤,分别接种于用RAYPA培养基制备分装仪提前分装好的 OA李斯特氏菌显色培养基平板和 PALCAM 培养基平板,36 ℃±1℃ 培养 24 h~48h,观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在 OA李斯特氏菌显色培养基平板上形成直径为1mm~3 mm 的圆形蓝绿色菌落,周围有不透明的晕圈。典型菌落在 PALCAM 培养基平板上形成直径为1mm~3 mm 的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,培养 48h后,部分菌落中心形成黑点且有凹陷。其他等效李斯特氏菌显色培养基平板上的菌落特征参照产品说明进行判定。
注 1:一些单核细胞增生李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。还有一些单核细胞增生李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落周围的晕圈出现得比较迟缓,有时需要 4d 以上才出现。
注 2:伊氏李斯特氏菌在 OA李斯特氏菌显色培养基上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似,
4、从每个平板中挑取3个~5 个典型或可疑菌落(少于3个全选),在 TSA-YE平板或羊血平板上划线,于36℃±1 ℃培养18h~24 h。单核细胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE平板或羊血平板上,呈灰白色,半透明,边缘整齐,露滴状菌落、直径为1 mm~2 mm。
 
5、筛选与鉴定
① 挑取 TSA-YE平板或羊血平板上的单个菌落,接种木糖、鼠李糖发酵管,于36℃±1℃培养 24 h±2 h，同时在 TSA-YE平板或羊血平板上划线,于 36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h,以获取下一步鉴定用的纯培养物。然后选择木糖阴性,鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
② 镜检:挑取 18 h~24 h纯培养的单个菌落做革兰氏染色镜检,李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4 μm~0.5 μm)X(0.5 μm~2.0 μm)。用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
③ 动力试验:挑取 18 h~24h纯培养的单菌落穿刺半固体或 SIM 动力培养基,于25 ℃~30 ℃培养 48 h±2 h。李斯特氏菌沿穿刺线以不规则的云雾状向四周延伸生长,培养基表面下3mm~5 mm处形成一似伞状(或梭状)界面。如伞状(或梭状)生长不明显,可继续培养,每天观察结果1次,观察5 d。
④ 生化鉴定:挑取 18 h~24h纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验、MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表 1。
⑤ 溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为 20个~25 个小格,挑取 18 h~24h纯培养的单个菌落刺种到血平板上,每格刺种1个菌落,并刺种阳性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌,伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,36 ℃±1℃培养 24 h~48 h,于明亮处观察,单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭窄、微弱的溶血环,英诺克李斯特氏菌无溶血环,伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的 8-溶血区域。

 
四、结果
综合以下结果，可判定为单核细胞增生李斯特氏菌：
1、增菌后在 OA 显色培养基（或等效培养基）和 PALCAM 培养基上形成典型菌落；
2、纯培养物为灰白色、半透明、露滴状菌落（直径 1-2mm）；
3、糖发酵试验为木糖阴性、鼠李糖阳性；
4、革兰氏阳性短杆菌，有旋转 / 翻滚样运动；
5、动力试验呈伞状（或梭状）生长；
6、过氧化氢酶阳性，且符合典型生化特征；
7、溶血试验呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈。