方案摘要：本方案整合 Pipetty 电动移液器与 RAYPA 培养基自动制备分装仪的技术优势。流程涵盖增菌培养、分离培养、 PCR 鉴定及生化确证试验：RAYPA 仪器实现 BPW、LST-Vm 肉汤等培养基的标准化制备与精准分装，保障培养基成分均匀、体积一致；Pipetty 电动移液器贯穿移液、接种、PCR 反应体系配制等关键环节，提升微升级操作精度。通过自动化仪器替代部分手动操作，减少人为误差与污染风险，增强检测结果的稳定性和可重复性，同时提升整体检测效率。最终结合菌落特征、生化鉴定及可选 PCR 结果，精准报告 100g (mL) 样品中克罗诺杆菌的检出情况，为食品微生物安全检测提供高效可靠的技术方案。
 
方案详情：
一、实验原理
       克罗诺杆菌定性检验核心是 “富集 - 筛选 - 验证 - 确证” 的递进逻辑。先以 BPW 培养基前增菌富集目标菌，再用 LST-Vm 肉汤选择性增菌抑制杂菌、扩增目标菌。通过克罗诺杆菌显色培养基的特异性显色反应，筛选出可疑菌落。可选 PCR 鉴定利用特异性引物，靶向扩增目标菌 282bp 特征基因片段，实现分子层面快速验证。最终通过生化鉴定，依据克罗诺杆菌独特的代谢生化特征，排除假阳性，确证菌株身份，最终判定样品中是否存在该菌。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器；
② 恒温培养箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒温水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振荡器；
⑦ 无菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 无菌培养皿:直径90mm；
⑨ pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
⑩ 微生物生化鉴定系统；
⑪ PCR仪；
⑫ 离心机:转速≥12000r/min；
⑬ 凝胶成像系统或紫外检测仪；
⑭ 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪；
⑮ PCR反应管；
⑯ RAYPA培养基自动制备分装仪；
 
2、试剂和材料
① 缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克罗诺杆菌显色培养基；
④ 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鉴定试剂盒；
⑥ 氧化酶试剂；
⑦ L-赖氨酸脱羧酶培养基；
⑧ L-鸟氨酸脱羧酶培养基；
⑨ L-精氨酸双水解酶培养基；
⑩ 糖类发酵培养基；
⑪ 西蒙氏柠檬酸盐培养基；
⑫ 内转录间隔区(its)PCR引物；
⑬ 5U/μL 耐热 DNA 聚合酶。
⑭ 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、25mmol/L MgCl₂；
⑮ 10×PCR 缓冲液、DNA 提取试剂、商品化 PCR 反应预混液；
⑯ 克罗诺杆菌质控菌株；
⑰ 大肠埃希氏菌质控菌株；
⑱ 核酸染色剂；
⑲ 分子质量标准:100 bp DNA ladder。
⑳ 50×TAE电泳缓冲液、6×DNA加样缓冲液。
 
三、实验步骤
1、用 RAYPA 培养基自动制备分装仪，按配方精准制备 BPW 培养基并预热至 41℃±1℃，通过仪器自动分装 900mL至无菌容器中。取100g (mL)检样加入 BPW容器，摇匀，36℃±1℃培养18h±2h 完成前增菌。用 Pipetty 电动移液器精准移取1mL前增菌液，转入由RAYPA提前制备并分装的10ml LST-Vm肉汤管中。41.5℃±1℃培养 24h±2h，完成选择性增菌。
 
2、分离培养
① 混匀 LST-Vm 肉汤培养物，用 Pipetty 电动移液器精准吸取 10μL 培养物。将吸取的培养物分别划线接种于2个克罗诺杆菌显色培养基平板。平板由 RAYPA提前自动制备，保证培养基厚度均匀、成分稳定，提升菌落生长一致性。36℃±1℃培养 24h±2h。
 
② 按显色培养基判定标准挑取可疑菌落，每个平板至少挑 5 个（不足则全挑），用 Pipetty辅助接种，分别划线接种 TSA 平板，36℃±1℃培养 24h±2h 备用。
3、PCR鉴定
① 从TSA平板挑 2-3 个可疑菌落至 500μL 灭菌去离子水中，混匀后 100℃加热 10min，冰浴冷却至室温。12000r/min 离心 10min，取上清液作为 DNA 模板。
② 引物：见表1。
 
② 反应体系：使用 Pipetty 电动移液器连续分液模式，按表 2 比例精准移取各组分，加入到PCR反应管中，使用电机代替人工操作，可有效避免人为误差，确保反应体系浓度均一，提升扩增重复性。
 
③ 反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性 30s、61℃退火 30s、72℃延伸 30s（35 个循环）；72℃延伸 5min，4℃保存。
3、每次 PCR 鉴定时使用克罗诺杆菌标准菌株 DNA 模板作为阳性对照,大肠埃希氏菌标准菌株DNA 模板作为阴性对照,提取过程设置灭菌去离子水作为 DNA 提取空白对照,PCR 反应需另设灭菌去离子水作为 PCR 反应体系空白对照。
4、用1×TAE电泳缓冲液制备含核酸染色剂的1.5%琼脂糖电泳凝胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面没过胶面。将适量PCR扩增产物与6×加样缓冲液混合后点样,其中第1孔加入 100 bp DNA ladder。电压的设置根据公式--电泳槽正负极的距离(cm)X5 V/cm计算并设置,电泳时间为 20 min~30 min。使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。也可采用毛细管电泳仪等设备进行电泳。
5、PCR鉴定结果判定
质控系统:阴性对照和空白对照均未出现扩增条带,阳性对照出现预期大小(282bp)的扩增条带,则检测系统正常。任一种对照出现非上述正常结果,应重做试验,同时排除干扰因素。
阳性结果:在质控系统正常的情况下,待测样品出现预期大小(282 bp)的扩增条带,判定 PCR 结果为阳性。
阴性结果:在质控系统正常的情况下,待测样品未出现预期大小(282 bp)的扩增条带,判定 PCR 结果为阴性。
6、确证实验
自 PCR 结果阳性的 TSA 平板上挑取菌落进行生化鉴定，PCR 结果阴性的 TSA 平板不再进行生化鉴定。
 
四、结果报告
根据菌落特征、PCR 鉴定结果,报告 100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌。