方案摘要：本方案旨在明确Pipetty电动移液器在牛羊副流感病毒实时荧光RT-PCR检测中的应用流程与核心价值。牛羊副流感是由副流感病毒引起的呼吸道传染病，快速精准检测病毒核酸对疫病防控至关重要。RT-PCR技术因高特异性、高灵敏度成为该病毒检测的核心方法，而移液精准度直接影响检测结果的可靠性。本方案通过整合Pipetty系列电动移液器的精准移液、连续分液等功能，应用于样本核酸提取、反转录及Real-time RT-PCR反应体系配制等关键步骤，结合荧光定量RT-PCR技术实现对BPIV3和CPIV3的快速、精准检测，为牛羊副流感的临床诊断与疫病防控提供技术支撑。
 
方案详情：

• 实验原理

本实验基于RT-PCR与荧光定量技术检测牛羊副流感病毒（BPIV3、CPIV3）核酸。病毒为单股负链RNA，经提取后逆转录为cDNA。通过特异性引物探针扩增目标cDNA，荧光仪实时检测信号并记录Ct值，结合阴阳性对照判定样本是否感染。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 荧光定量PCR仪；
③ 台式离心机；
④ 高速台式冷冻离心机；
⑤ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同规格)；
⑥ 生物安全柜。
 
2、试剂和材料
① 病毒RNA 提取试剂盒；
② 反转录试剂盒；
③ Real-time RT-PCR预混液或一步法 Real-time RT-PCR预混液；
④ Real-time RT-PCR用引物和荧光探针；
⑤ BPIV3阳性对照；
⑥ CPIV3阳性对照；
⑦ 离心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同规格)；
⑧ 荧光定量PCR反应管。
 
三、实验步骤
1、样本经预处理后取上清，采用Pipetty电动移液器精准移取样本至提取管，配合病毒RNA提取试剂盒完成核酸提取。
2、用反转录试剂盒将提取的核酸进行反转录，获得的cDNA置于-20℃冰箱中保存备用。若使用一步法荧光定量RT-PCR预混液可省略此步骤。
3、将Real-time RT-PCR反应各试剂置于冰上融化后，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，配制Real-timeRT-PCR反应体系，将cDNA模板分别加入相应荧光定量PCR反应管中，同时设阳性对照和阴性对照(去离子水)，对反应管进行编号。盖紧管盖后，500r/min离心30s。
2×探针法定量PCR Mix      10μL
上游引物                   1μL
下游引物                   1μL
探针（10μmol/L）          1μL
无核酶的双蒸水             6μL
cDNA模板                 1μL
总体积                     20μL
 
4、将加样后的荧光定量 PCR反应管放入荧光定量PCR仪中，Real-time RT-PCR检测病毒核酸的反应程序，按照表D.4进行。
 
 
四、结果判定
1、阴性对照Ct值>35，且无典型扩增曲线;阳性对照Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，判为试验成立。否则应重新进行试验。
2、被检样品Ct值≤35，且出现特异性扩增曲线，判为病毒核酸检测阳性;被检样品无Ct值或无特异性扩增曲线，判为病毒核酸检测阴性。被检样品Ct值>35，且出现特异性扩增曲线，需复检。复检Ct值>35，且出现特异性扩增曲线，判为病毒核酸检测阳性;无Ct值或无特异性扩增曲线，判为病毒核酸检测阴性。BPIV3和CPIV3检测结果图分别见图E.3和图E.4。