方案摘要：本方案在牛羊副流感病毒（牛副流感病毒3型BPIV3、羊副流感病毒3型CPIV3）中和试验中使用Pipetty电动移液器，并结合该仪器精准度高、操作稳定、适配性强的核心优势，规范实验准备、样品处理、血清稀释、病毒孵育及细胞接种等关键环节，确保实验结果的可靠性与重复性，为牛羊副流感病毒感染的血清学检测提供标准化技术支撑。
 
方案详情：

• 实验原理

通过待检血清中的中和抗体与牛羊副流感病毒（BPIV3/CPIV3）特异性结合，抑制病毒对敏感MDBK细胞的感染和致病变作用（CPE）。利用Pipetty电动移液器精准控制血清稀释比例、病毒液及细胞悬液加样量，通过观察细胞病变情况，采用Reed-Muench法计算血清中和抗体效价，从而判定待检血清中是否存在特异性中和抗体及效价水平，为临床疫病诊断和免疫效果评估提供依据。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 台式离心机；
③ CO₂恒温培养箱；
③ 生物安全柜；
④ 倒置显微镜；
⑤ 细胞计数仪；
⑥ 冰箱(2℃~8℃、-20℃、-70℃等不同规格)。
 
2、试剂和材料
① 96孔细胞培养板；
② 96孔U型板；
③ MDBK细胞；
④ MEM培养基；
⑤ FBS、马血清；
⑥ 0.5%胰酶消化液；
⑦ 阳性血清、阴性血清、待检血清(血清经56℃水浴灭活30min)；
⑧ 病毒液(50pL含50TCID50~300TCID50的病毒)。
三、实验步骤
1、将血液样品以2000r/min离心5min~10min，在生物安全柜内，使用Pipetty电动移液器配合无菌吸头，精准吸取上层血清至无菌离心管中，避免吸入血细胞，待检。
2、将MDBK传代细胞用0.5%胰酶消化液消化后，用细胞培养液分散细胞，通过细胞计数仪计数后，将细胞稀释至1×10⁶个/mL~2×10⁶个/mL。使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，以每孔100μL的量精准分装至96孔细胞培养板中。将培养板置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中静置培养24h，形成90%~95%融合单层细胞，备用。
 
3、在生物安全柜内，取96孔U型板，使用Pipetty电动移液器，使用混匀模式，用MEM培养基将待检血清在96孔U型板上从1:4开始进行倍比稀释，连续稀释8个稀释度，最终稀释至1:512，每孔保留稀释后的血清50μL。每份血清设置4个重复孔，确保实验重复性。
4、设立阳性血清对照、阴性血清对照、正常细胞对照和接毒细胞对照，每个对照设置2个重复孔。检测牛、羊血清时阳性和阴性对照样品分为:
a)检测牛血清样品，使用BPIV3阳性牛血清、阴性牛血清和BPIV3作为对照;
b)检测羊血清样品，使用CPIV3阳性山羊或绵羊血清、阴性山羊或绵羊血清和CPIV3作为对照。
5、使用连续分液功能向96孔U型板中每孔精准加入50μL病毒液，将U型板置于37℃恒温环境中孵育1h。
 
6、孵育结束后，在生物安全柜内，使用Pipetty电动移液器将样品精准接种至已制备好的MDBK单层细胞的96孔细胞培养板对应孔中，接种过程中避免移液器枪头触碰细胞层，防止损伤单层细胞。接种完成后，将培养板放入37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养72h，期间每日通过倒置显微镜观察细胞生长状态。
7、培养72h后，取出培养板，通过倒置显微镜观察并记录每份血清各稀释度孔的细胞病变（CPE）情况，判断标准为：无CPE记为中和阳性，出现CPE记为中和阴性。采用Reed-Muench法计算血清的中和抗体效价，即能抑制50%细胞出现CPE的血清最高稀释倍数。
 
四、结果判定
1、正常细胞对照孔和阳性血清对照孔细胞生长正常，无CPE出现；阴性血清对照孔和病毒对照孔细胞出现明显CPE，方可判定试验成立，结果有效。若对照孔不符合上述条件，需重新进行实验。
2、被检血清中和抗体效价≥1:4，判定为阳性，提示被检牛羊曾感染或接种过对应副流感病毒，体内产生特异性中和抗体；被检血清中和抗体效价<1:4，判定为阴性，提示被检牛羊未产生有效中和抗体（需结合临床情况排除感染初期等特殊情况）。