方案摘要：本方案针对牛羊副流感病毒抗体cELISA检测的精准性与高效性需求，整合Pipetty电动移液器的核心优势，构建标准化检测流程。该移液器具备连续分液功能，可实现多孔试剂的均匀精准分配；其自动记忆六次分液程序一键调节分液次数的特性，能大幅简化手动调节分液量的操作，减少人为误差与操作耗时。方案通过补足实验原理、优化操作步骤，明确借助该移液器完成样品稀释、加样、抗体添加等关键环节，结合cELISA竞争结合机制实现抗体定性检测，为牛羊副流感疫病的快速筛查、流行病学监测提供稳定可靠的技术支撑，提升基层实验室与规模化检疫的检测效率。
 
方案详情：

• 实验原理

通过抗原抗体特异性竞争结合反应实现牛羊副流感病毒抗体的检测。预先将牛羊副流感病毒抗原包被于酶标板孔内，当加入待检血清后，血清中若存在副流感病毒特异性抗体，会优先与包被抗原结合形成抗原-抗体复合物；随后加入的酶标单克隆抗体（竞争抗体），将因包被抗原结合位点被占据而无法有效结合，且待检血清中特异性抗体浓度越高，对酶标单克隆抗体结合的抑制作用越强。加入TMB底物显色液后，酶标单克隆抗体上的酶可催化底物发生显色反应，其显色强度与酶标单克隆抗体的结合量正相关。通过酶标仪读取450nm波长下的OD值，依据公式计算血清阻断率（PI），即可判定待检血清中抗体的阳性/阴性状态。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 台式离心机；
③ 往复式微量振荡器；
④ 涡旋混合振荡器；
④ 酶标仪；
⑤ 洗板机；
⑥ 恒温培养箱；
⑦ 冰箱(2-8℃、-20℃、-70℃等不同规格)；
 
2、试剂和材料
① 样品稀释缓冲液；
② 20倍浓缩洗涤液；
③ 终止液；
④ TMB底物显色液；
⑤ 病毒标准阳性血清；
⑥ 病毒标准阴性血清；
⑦ 抗原包被酶标板；
⑧ 酶标单克隆抗体。
 
三、实验步骤
1、将所有试剂从冰箱取出，平衡至室温；取出20倍浓缩洗涤液充分混悬，确认析出的盐类完全溶解后，用去离子水按1:20比例稀释备用。提前调试Pipetty电动移液器，根据实验设计，利用其自动记忆功能预设3-4组常用分液程序，后续可一键切换，减少操作中的参数设置时长。
 
2、取出包被病毒抗原的酶标板，使用Pipetty电动移液器的连续分液功能，向每孔精准加入40μL样品稀释缓冲液；更换吸头，向样品孔加入10μL制备好的待检血清；更换吸头，同步向2个阳性对照孔、2个阴性对照孔分别加入10μL阳性血清、阴性血清；更换吸头，最后向2个空白对照孔各加入50μL样品稀释缓冲液。
3、用样品稀释缓冲液将酶标单克隆抗体稀释至工作浓度，使用连续分液功能，每孔加入50μL，轻轻振荡酶标板，使血清与酶标单克隆抗体反应液充分混匀，37C孵育60min。
 
4、取出酶标板，迅速甩出酶标板内的溶液至含有灭活剂的废液缸中。每孔加入300μL洗涤液，迅速翻转酶标板将孔内洗涤液甩至盛有灭活剂的废液缸中，将酶标板倒置在干净的吸水纸上，拍干。洗涤3次~5次。
5、使用连续分液功能，每孔加入l00μL TMB底物显色液，37C孵育10min。
 
6、每孔加入50μL终止液。
7、加入终止液后，于450nm波长下，读取每孔的OD值。
8、血清阻断率的计算见公式(1):
PI=(1-S/N)x100%......................(1)
式中:
PI 血清阻断率;
S 阳性对照或阴性对照或待检样品的OD值;
N 空白对照OD平均值。
 
四、结果判定
1、当空白对照孔0.8≤OD值≤1.5、阳性对照孔PI>80%、阴性对照孔PI≤30%时，判为试验成立，否则重新进行试验。
2、当被检牛血清样品的PI＞38%时，判定为血清抗体阳性；当被检羊血清样品的PI＞35%时，判定为血清抗体阳性。当被检牛血清样品的PI≤38%时，判定为血清抗体阴性;被检羊血清样品的PI≤35%时，判定为血清抗体阴性。