方案摘要：本方案利用Pipetty电动移液器精准完成样品移取、培养液分装等关键操作，结合细胞培养、样品接种、病毒传代及鉴定等步骤，实现犬细小病毒的高效分离与准确鉴定，为犬细小病毒病的诊断及相关研究提供标准化实验方法，同时凸显Pipetty电动移液器在提升实验精准度、重复性及效率方面的优势。
 
方案详情：

• 实验原理

犬细小病毒（CPV）可在猫肾细胞系（FK81细胞）中增殖，增殖过程中会导致宿主细胞出现特征性病变（CPE），表现为细胞变圆、拉丝、脱落等现象。本实验通过无菌操作处理待检样品，利用Pipetty电动移液器精准移取样品上清液接种至FK81细胞中，在适宜培养条件下培养，观察细胞病变情况。若出现特征性CPE，经反复冻融、离心处理后，采用指定方法进行病毒鉴定，从而实现犬细小病毒的分离与确认。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty电动移液器MSI-03-1000；
② 冰箱(4C、-20℃、-70℃)。
③ 二氧化碳培养箱(37℃）。
④ 倒置显微镜。
⑤ 电子天平:精度0.1mg。
⑥ 细胞培养瓶(25cm2或75cm2等)。
⑦ 0.22m微孔滤器。
 
2、试剂和材料
① 试验用水，符合GB/T6682的规定。
② DMEM培养液，按照A.3配制。
③ 新生牛血清。
④ FK81细胞(猫肾细胞系)。
 
三、实验步骤
1、使用Pipetty电动移液器吸取6mL含8%新生牛血清的DMEM培养液，精准注入25cm²细胞培养瓶中，接种FK81细胞后，置于37℃、5%（体积分数）二氧化碳培养箱中培养，待细胞生长至适宜密度后，即可进行待检样品接种。
 
2、采用同步接种方法，通过Pipetty电动移液器取处理好的样品上清液1mL，经0.22μm微孔滤器过滤除菌后，精准接种于已培养好的FK81细胞培养瓶中，置于37℃、5%（体积分数）二氧化碳培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞状态并记录细胞病变结果，连续观察3d~5d。
3、CPV在FK81细胞上培养，一般培养3d~5d后，会出现细胞变圆、拉丝、脱落等特征性CPE。若样品初次接种FK81细胞后，培养5d仍无CPE，需用Pipetty电动移液器吸取1mL该细胞培养瓶中的细胞培养液，精准移入新的FK81细胞培养瓶内（即第2代），继续置于37℃、5%（体积分数）二氧化碳培养箱中培养5d，每日观察并记录细胞病变情况。无CPE的样品培养物需按上述方法盲传5代。
 
4、若细胞在初次接种样品或盲传5代后出现特征性CPE，将细胞培养瓶用封口膜封口，放入-70℃冰箱中冻存，取出后室温融化，反复冻融两次以充分释放病毒。随后用Pipetty电动移液器将细胞培养液移入10mL离心管中，在4℃、3000r/min条件下离心20min，取上清液作为待检样品。采用HI/HV、PCR、荧光PCR任一方法，对上清液中的病毒进行犬细小病毒特异性鉴定。
四、结果与报告
1、初次接种样品或盲传5代后出现CPE，并经HI/HV、PCR、荧光PCR任一方法，检测结果为阳性，判为CPV分离阳性。
2、初次接种样品和盲传5代后均未出现CPE，或出现CPE但经过HI/HV、PCR、荧光PCR任一方法，检测结果为阴性，判为CPV分离阴性。