方案摘要：本方案旨在建立基于Pipetty电动移液器的牛羊副流感（BPIV3/CPIV3病毒核酸精准检测流程。通过Pipetty电动移液器的高精度移液与连续分液功能，实现样本核酸提取、RT-PCR反应体系配制、产物移取等全流程标准化操作，规避手动移液误差。流程核心为：样本预处理后提取病毒RNA，经反转录获得cDNA，精准配制PCR反应体系并设置阴阳性对照，上机扩增后通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。该方案借助Pipetty电动移液器的温度补偿、轻便操作等优势，提升检测效率与结果可靠性，适配养殖场、检测机构等批量牛羊样本的副流感病毒快速筛查。
 
方案详情：

• 实验原理

牛羊副流感病毒（BPIV3、CPIV3）为单股负链RNA病毒，本实验基于逆转录-聚合酶链反应技术，利用特异性引物对病毒RNA进行靶向检测。首先通过病毒RNA提取试剂盒裂解样本、释放病毒RNA，在反转录酶作用下将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）；随后以cDNA为模板，在PCR预混液提供的酶、dNTPs等条件下，通过引物特异性结合病毒靶基因序列，经PCR仪升温变性、降温退火、恒温延伸的循环反应，实现靶基因片段的大量扩增。最终通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，依据特异性条带的有无及大小判定样本是否感染BPIV3或CPIV3，阴性对照无条带、阳性对照出现特异条带则试验成立，样本出现预期条带即为病毒核酸阳性。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty Pro 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR 仪；
③ 电泳仪和水平电泳槽；
④ 凝胶成像仪或紫外透射仪；
⑤ 台式离心机；
⑥ 高速台式冷冻离心机；
⑦ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同规格)；
⑧ 生物安全柜。
 
2、试剂和材料
① 引物；
② BPIV3阳性对照；
③ CPIV3阳性对照；
④ 病毒RNA提取试剂盒；
⑤ 反转录试剂盒；
⑥ PCR预混液或一步法RT-PCR预混液；
⑦ 离心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同规格)；
⑧ PCR反应管。
 
三、实验步骤
1、样本经预处理后取上清，采用Pipetty电动移液器精准移取样本至提取管，配合病毒RNA提取试剂盒完成核酸提取。
2、用反转录试剂盒将提取的核酸进行反转录，获得的cDNA置于-20℃冰箱中保存备用。若使用一步法RT-PCR预混液可省略此步骤。
3、将PCR反应各试剂于冰上融化后，借助Pipetty电动移液器的高精度连续分液功能，配制RT-PCR反应体系，将cDNA模板分别加入相应PCR反应管中，同时设阳性对照和阴性对照(去离子水)，对PCR反应管进行编号。盖紧管盖后，500r/min离心30s。
上游引物（10 μmol/L）    0.5μL
下游引物（10 μmol/L）    0.5μL
2×PCR Mix                12.5μL
无核酶水                  9.5μL
cDNA模板                  2.0μL
总体积                    25.0μL
 
4、将加样后的PCR反应管放入PCR仪中，按照表D.2中BPIV3或CPIV3的RT-PCR反应程序进行。若采用一步法RT-PCR预混液，可按照说明书操作。
5、 用Pipetty取PCR产物5uL~10uL，在1%~1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，使用凝胶成像系统或紫外透射仪观察结果。
 
四、结果判定
1、阴性对照无扩增条带，阳性对照出现符合大小的特异扩增条带，判为试验成立。
2、样品出现预期大小的扩增片段时，判定为病毒核酸检测阳性。样品未出现预期大小的扩增片段，判定病毒核酸检测阴性。BPIV3和CPIV3阳性结果对照图分别见图E.l和图E.2。