方案摘要：本方案旨在界定Pipetty电动移液器在猪格拉瑟病（副猪格拉瑟菌）巢式PCR检测中的具体应用流程，通过标准化实验操作，结合该移液器精准、高效的液体处理优势，实现对副猪格拉瑟菌的快速、准确检测。方案涵盖实验原理、实验准备、操作步骤及结果判定等核心环节，为畜牧兽医领域开展猪格拉瑟病检测工作提供标准化技术参考，保障检测结果的可靠性与重复性，助力疫病的早发现、早防控。
 
方案详情：
一、实验原理
副猪格拉瑟菌为革兰氏阴性菌，是猪格拉瑟病的致病菌，本实验采用巢式PCR技术，以副猪格拉瑟菌DNA为检测靶标，通过两轮特异性扩增对靶标基因进行富集与扩增。Pipetty电动移液器精准移取各反应试剂，构建标准化PCR反应体系，经扩增仪完成循环扩增后，通过电泳检测扩增产物，依据特异性条带的出现情况判定样品中是否含有副猪格拉瑟菌。巢式PCR技术凭借两轮扩增的特异性筛选，可显著提高检测的灵敏度与特异性，结合Pipetty电动移液器的高精度移液能力，有效降低实验误差，提升检测准确性。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自动化核酸提取仪；
③ PCR扩增仪；
④ 台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上)；
⑤ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像仪(或紫外透射仪)。
 
2、试剂和材料
① 阳性对照：灭活的副猪格拉瑟菌标准菌株；
② 阴性对照：灭菌的TSB培养基；
③ 上、下游引物;
④ 核酸提取试剂盒。
三、实验步骤
1、采用核酸提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取猪临床样品中的副猪格拉瑟菌DNA。提取过程中，使用Pipetty电动移液器，精准移取提取试剂及样品，严格按照试剂盒说明书操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h内进行检测，可将DNA置于冰上临时保存；若需长时间存放，应置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
2、使用Pipetty电动移液器精准移取各试剂，构建总体积为25μL的反应体系，具体试剂用量如下：
10×PCR缓冲液（含Mg²⁺）      2.5μL
dNTPs（2.5 mmol/L）            2μL
引物P1                         0.5μL
引物P2                         0.5μL
ExTag DNA聚合酶（5U/μL）      0.25μL
灭菌双蒸水                     17.25μL
上述试剂总体积为23μL，室温融化后，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，将上述试剂移取至PCR反应管中，每移取一种试剂后更换枪头，避免交叉污染。试剂加完后，将反应管置于台式低温高速离心机中瞬时离心，使液体全部聚集在管底部。随后，用Pipetty电动移液器移取2μL制备好的样品核酸，加入反应管中，混匀模式，充分混匀后再次瞬时离心，确保液体完全聚集于管底，避免局部试剂浓度不均影响扩增效果。
 
3、将配制好的反应管放入PCR扩增仪中，设置如下程序：95℃预变性5min，彻底打开DNA双链；随后进入循环阶段，94℃变性45s（使DNA双链解旋）、58℃退火45s（使引物与靶基因特异性结合）、72℃延伸45s（DNA聚合酶催化链延伸），共进行35个循环；最后72℃延伸10min，确保扩增产物完全延伸。反应结束后，取出反应管，置于2℃~8℃条件下保存，备用。
4、采用与第一轮相同的体积配比，构建总体积23μL的反应体系Ⅱ，室温融化后，使用Pipetty电动移液器精准移取各试剂，更换枪头防污染，室温融化后瞬时离心，再加入2μL第一轮PCR扩增产物作为模板，混匀后瞬时离心，确保反应体系均一。
 
5、扩增条件与上一轮一致，反应结束后，置于2℃~8℃保存，待电泳检测。
6、称取1.2g琼脂糖加入100mL核酸电泳缓冲液中加热至沸腾，充分溶化后放凉至50℃左右，加入核酸染色剂10μL，混匀，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入1×TAE核酸电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物10μL和2μL 6×电泳上样缓冲液混合后，分别加样到各凝胶孔中，取5μL DNA分子质量标准加入一凝胶孔中。5V/cm恒压下电泳30min左右，将电泳好的凝胶置紫外投射仪或凝胶成像系统中观察结果，进行判定并做好试验记录。
四、结果判定
1、试验结果成立条件
副猪格拉瑟菌阳性对照的巢式PCR扩增产物电泳后在312bp位置出现特异性条带，同时阴性对照的PCR扩增产物电泳后没有任何条带，则试验结果成立；否则结果不成立。
2、阳性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品的PCR产物电泳后在312bp位置上出现特异性条带，判定为副猪格拉瑟菌通用型核酸检测阳性。
3、阴性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品在312bp位置未出现特异性条带，判定为副猪格拉瑟菌通用型核酸检测阴性。