方案摘要：本方案结合了Pipetty电动移液器的产品优势，通过精准移取实验试剂与样品，保障核酸提取、PCR反应体系配制等关键步骤的准确性与重复性，减少人为操作误差导致的检测偏差，实现对猪临床样品中副猪格拉瑟菌的快速、灵敏、特异性检测，为临床疫病诊断与防控提供可靠技术支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
副猪格拉瑟菌为革兰氏阴性菌，是引起猪格拉瑟氏病的病原体，可导致猪出现关节炎、胸膜炎、脑膜炎等症状，对养猪业危害严重。本实验基于荧光实时PCR技术，利用副猪格拉瑟菌特异性引物与MGB探针，针对病原体基因组中保守序列进行靶向扩增。在PCR扩增过程中，探针与目的片段特异性结合，随着扩增循环进行，荧光信号不断累积，通过实时荧光PCR仪检测荧光信号变化，可实现对样品中副猪格拉瑟菌的定性检测。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自动化核酸提取仪；
③ 实时荧光PCR仪；
④ 台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上)。
 
2、试剂和材料
① 副猪格拉瑟菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列；
② 阳性对照；
③ 阴性对照；
④ 核酸提取试剂盒。
三、实验步骤
1、采用核酸提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取猪临床样品中的副猪格拉瑟菌DNA。提取过程中，使用Pipetty电动移液器，精准移取提取试剂及样品，严格按照试剂盒说明书操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h内进行检测，可将DNA置于冰上临时保存；若需长时间存放，应置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
 
2、每个样品设置3个重复孔，同时设置阳性对照、阴性对照各3个重复孔，按以下比例配制25μL反应体系，所有试剂均通过Pipetty电动移液器精准移取：
10×PCR缓冲液（含Mg²⁺）            2.5μL
dNTPs混合物                          2.0μL                
上游引物（FQ-P1）                    0.5μL
下游引物（FQ-P2）                    0.5μL
MGB探针                              0.5μL
ExTag DNA聚合酶                      0.25μL
灭菌双蒸水                           16.75μL
DNA模板                              2.0μL
合计                                  25μL
体系配制完成后，轻柔振荡混匀，置于台式低温高速离心机中，以3000r/min离心30s，使液体全部聚集于管底，避免气泡影响荧光信号采集。按样品顺序将反应管放入实时荧光PCR仪样品槽，做好标记。
 
3、第一阶段,94C预变性5min；第二阶段，94C变性30s，60C延伸30s，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为FAM/NONE双标记模式。
 
四、结果判定
1、阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值>32.0或无；阳性对照的Ct值应≤29.0，且出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。
2、Ct值≤29.0，而且出现特定的扩增曲线，则判定为副猪格拉瑟菌通用型阳性。
3、Ct值>32.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为副猪格拉瑟菌通用型阴性。
4、29.0