方案摘要：本方案通过结合Pipetty电动移液器，利用其精准移液控制提升实验重复性与准确性，保障了加样步骤的准确性与重复性，减少人为操作误差导致的检测偏差，实现对猪临床样品中副猪格拉瑟菌的快速、灵敏、特异性检测，为副猪格拉瑟菌感染的快速筛查与确诊提供标准化实验依据，为临床疫病诊断与防控提供可靠技术支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
间接ELISA技术基于抗原抗体特异性结合及酶催化底物显色的原理，用于检测样品中针对副猪格拉瑟菌的特异性抗体。本实验以副猪格拉瑟菌重组P2蛋白作为包被抗原，吸附于96孔酶标板表面；加入待检血清后，血清中若存在副猪格拉瑟菌特异性抗体，会与板上包被抗原结合形成抗原-抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG酶标抗体，该酶标抗体可与复合物中的猪IgG特异性结合；最后加入TMB底物溶液，HRP可催化底物显色，显色程度与待检血清中特异性抗体含量呈正相关。通过酶标仪测定450nm波长下的吸光值，结合公式计算与判定标准，可判断待检样品是否为阳性。
 
二、‌实验准备
1、仪器设配
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 酶标仪；
③ 恒温箱；
④ 洗板机或洗涤瓶；
⑤ 96孔酶标板；
⑥ U形96孔稀释板；
⑦ 贮液槽。
 
2、试剂和材料
① 包被抗原:副猪格拉瑟菌重组P2蛋白；
② 酶标抗体:兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶；
③ 对照:副猪格拉瑟菌抗体阳性对照(阳性血清)、阴性对照(阴性血清)；
④ 包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶结合物稀释液、终止液；
⑤ 底物溶液:商品化即用型TMB底物溶液。
三、实验步骤
1、取96孔酶标板，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，将经包被缓冲液稀释至工作浓度（0.5μg/mL）的副猪格拉瑟菌重组P2抗原，每孔加入100μL；置于4℃冰箱过夜（16h~22h）。弃去板中包被液，用Pipetty电动移液器每孔加入300μL洗涤液，洗涤1次，甩掉洗涤液并在吸水纸上拍干残留液体。每孔加入120μL封闭液，置于37℃恒温箱内孵育2h，或4℃过夜16h~22h。封闭结束后，弃去板中的封闭液，于吸水纸上拍干，室温干燥后置于4℃干燥保存。
 
2、在U形96孔稀释板中，用样品稀释液将待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清分别作1:100稀释。使用Pipetty电动移液器连续分液模式，每孔加入100μL稀释后的血清样品，每个对照血清各做两孔重复，将酶标板置于37℃温箱内反应60min。取出反应板，弃去反应液，用Pipetty每孔加入300μL洗涤液，洗涤5次，每次洗涤后在吸水纸上拍干。
3、用样品稀释液将兔抗猪IgG-辣根过氧化物酶作1:5000稀释至工作浓度。使用Pipetty连续分液模式，每孔加入100μL稀释后的酶标抗体，置于37℃温箱内反应30min。取出反应板，弃去反应液，用洗涤液每孔加300μL，洗涤3次。
4、每孔加入100μL TMB底物溶液，置于37℃温箱内避光反应15min。
5、反应结束后，每孔加入50μL终止液，终止反应。
 
6、酶标仪读取各孔吸光值(OD_450nm，指在波长450nm的光密度值）。
四、数据分析

 
五、结果判定