方案摘要：本方案围绕羊莫氏巴贝斯虫巢式 PCR 检测全流程，深度结合 Pipetty 电动移液器精准移液、微量分液、模式化操作、程序记忆、低残留吸排等核心优势，覆盖基因组 DNA 加样、巢式 PCR 反应体系配制、内外引物精准添加、PCR Mix 等分、无酶水补足等关键步骤。相较于传统手动移液器，Pipetty 电动移液器可实现微量体积精准移取、多管快速等分、匀速吸排液，避免手动操作导致的微量体积误差、交叉污染及手法差异；标准化移液程序消除人为按压力度、吸排速度带来的操作偏差，降低长时间实验手部疲劳，显著提升 PCR 体系配制效率、扩增重复性与检测准确性，为羊莫氏巴贝斯虫病原筛查、定性检测提供高效、标准化、可追溯的操作支撑。
 
 
方案详情：
一、实验原理
      巢式 PCR 通过两轮 PCR 扩增实现羊莫氏巴贝斯虫核酸高灵敏度检测：第一轮使用外引物（TBall 136S / TBall 936AS）对样本基因组 DNA 进行初次扩增，富集目标片段；第二轮以内引物（BLT 623S / BLT 911AS）对第一轮扩增产物进行二次扩增，进一步提升特异性与检出限。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 微量离心机；
③ 涡旋混匀器；
④ 实时荧光定量 PCR 仪；
⑤ 普通基因扩增仪；
⑥ 电泳仪；
⑦ 凝胶成像系统；
⑧ 生物安全柜；
⑨ 低温冰箱（-20℃）、冰盒。

 
2、试剂和材料
①  外引物
TBall 136-S(正向外引物)    5'-CATGGATAACCGTGCTAATT-3
TBall936-AS(反向外引|物)  5'-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3'
② 内引物
BLT623-S:(正向内引物)      5'-ATCGCGTGCTTTTGGT-3'
BLT911-AS:(反向内引物)    5'-AGGACTACGACGGTATCTGA-3'
③ 2×Premix Taq 酶预混液；
④ 无 DNase/RNase 纯水；
⑤ 羊莫氏巴贝斯虫阳性对照 DNA、阴性对照 DNA；
⑥ 血液基因组 DNA 提取试剂盒、琼脂糖、电泳缓冲液、核酸染料等。
 
三、实验步骤
1、用商品化的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组 DNA，方法按照试剂盒说明书。提取的DNA立刻用于PCR扩增或-20℃保存备用。
2、使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，按照 2×Premix Tag 酶 12.5uL,TBall 136-S 和 TBall 936-AS引物(20pmol）各0.5uL,基因组 DNA或外引物扩增产物1uL，无DNase/RNase水10.5uL，配制25uL的反应体系。莫氏巴贝斯虫阴性和阳性基因组DNA对照分别作为标准阴、阳性对照。
 
3、外引物扩增:于PCR仪中94℃预变性3 min;94℃变性30 s,55℃退火40 s,72℃延伸1 min，共扩增40个循环;72℃延伸10min,进行扩增。
4、内引物扩增:于PCR仪中，94℃预变性3 min;94℃变性30s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共扩增40个循环;72℃延伸10min,进行扩增。
 
 
四、结果判定
使用Pipetty电动移液器，取内引物扩增产物10uL,进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
结果判定:标准阳性对照扩增出大小约288bp的特异性条带，标准阴性对照无扩增条带，判为试验有效;同时待检样品扩增出288 bp的条带，判为莫氏巴贝斯虫核酸阳性，未扩增出288bp的条带，判为莫氏巴贝斯虫核酸阴性(见图C.1)。