方案摘要：本方案覆盖猪口蹄疫 3ABC-B-ELISA 全流程，借助 Pipetty 电动移液器精准移液、程序记忆等优势，优化批量加样、试剂稀释等关键操作。设备控量稳定、吸排液匀速，可规避手动操作误差，缓解实验疲劳，提升检测重复性与孔间一致性，保障检测结果准确可靠，规范实验流程，高效支撑口蹄疫血清筛查与流行病学监测工作。
 
方案详情：
一、实验原理
       3ABC-B-ELISA 为猪口蹄疫野毒鉴别检测方法，依托病毒非结构蛋白 3ABC 开展阻断反应。灭活疫苗免疫猪不产生 3ABC 抗体，仅野毒感染猪会特异性产生该抗体。试验以 3ABC 抗原包被酶标板，样本抗体与酶标单抗竞争结合抗原，通过显色程度判定结果，可快速区分疫苗免疫与野毒感染，常用于猪场疫病排查与流行病学监测。
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
 
2、试剂
① 阴性对照血清；
② 阳性对照血清；
③ 弱阳性对照血清；
④ 25倍浓缩PBS缓冲液；
⑤ 3ABC蛋白捕获抗体；
⑥ 酶标检测抗体贮存液；
⑦ 血清稀释液；
⑧ ELISA用TMB底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 捕获3ABC抗原反应板。
 
      
三、实验步骤
1、取出密封的捕获3ABC抗原反应板，所有的试剂在使用前应先恢复至15 ℃~25℃，通过涡旋振荡器轻振血清样品混匀。
2、使用Pipetty电动移液器的连续分液模式，每孔加入80uL血清稀释液，然后更换吸头，依次加入20uL待测血清和阳、弱阳性与阴性对照血清。待测样品加1孔，阴性、弱阳性与阳性对照血清平行加2孔，振荡混匀，封口膜封口，在15℃~25℃条加下振荡孵育。检测牛、羊血清时，孵育1h;检测猪血清时,孵育16h~20h。小心去掉封口膜，每孔加约300uL洗涤液洗板5次，最后一次拍干。
 
3、用血清稀释液1:100比例稀释100倍浓缩酶标单抗，使用Pipetty，每孔加入100uL，封口膜封口，置15℃~25℃孵育1h。小心去掉封口膜，每孔加约300uL洗涤液洗板5次,最后一次拍干。
4、用Pipetty连续分液模式，每孔加入100 uL TMB底物溶液,封口膜封口,置15 ℃~25℃避光孵育10 min~15 min。
 
5、每孔加入100uL终止液，在450nm测量和记录各样品和对照品的吸光值。加终止液之前，可以测定OD_630nm值，将OD_630nm值控制在0.5~0.6之间，保证最佳的检测效果,终止前OD_630nm值约为终止后OD_630nm值的1/3。
 
四、试验结果有效性判定
1、计算阴性、弱阳性与阳性对照血清平均OD_450nm值。根据公式计算测试样本(弱阳性、阳性对照血清与待测血清)阻断率(PI),PI=(1-测试样本OD_450nm值/阴性对照平均OD_450nm值)×100%。
2、结果有效性判定:阴性对照平均OD_450nm值应大于1.0，弱阳性对照血清阻断率应大于50%，阳性对照血清阻断率应大于70%，试验有效。

五、结果判定
试验结果有效，被检血清样品PI值大于或等于50%，判定为FMDV NSP3ABC抗体阳性;
被检血清样品PI值小于50%，判定为FMDVNSP3ABC抗体阴性。