方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫LPB-ELISA全流程，结合Pipetty 电动移液器精准移液、微量分液、程序记忆等优势，优化批量加样、梯度稀释、微量试剂添加等关键操作。通过匀速稳定吸排液、精准控量，减少手动移液按压力度不均、速度差异、手部抖动带来的体积误差，缓解长时间操作疲劳，提升实验重复性与加样均一性，保障结果稳定可靠，为口蹄疫血清鉴别、病原筛查、流行病学监测提供标准化、可追溯的操作支持，有效提升检测效率、降低实验误差、规范操作流程。
 
 
 
方案详情：
一、实验原理
       猪口蹄疫 LPB-ELISA 即液相阻断 ELISA，原理是利用病毒抗原与酶标抗体竞争结合待检血清中的特异性抗体。血清先与病毒抗原充分反应，再加入包被在微孔板上的酶标抗体。若血清含中和抗体，会优先结合病毒抗原，阻断其与酶标抗体结合，显色变浅；无抗体则酶标抗体与抗原结合，显色较深。通过测定吸光度并计算阻断率，判定血清抗体水平，可快速评估口蹄疫免疫效果。
二、‌实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
2、试剂
① 捕获抗体；
② 检测抗体；
③ 对照抗原；
④ 被缓冲液；
⑤ 样品稀释液；
⑥ 酶标抗体稀释液；
⑦ 洗涤缓冲液；
⑧ 底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 兔抗豚鼠IgGHRP标记物。
 
      
 
三、实验步骤
1、使用Pipetty电动移液器的连续分液功能，将工作浓度的捕获抗体分别包被ELISA板第1列至第12列(也可根据待检样品数量调整包被孔数),按O、A、Asia 1型的顺序包被酶标板，每个血清型包被1列，每孔加50uL，用封板膜封板,置于4℃过夜(或38℃±0.5℃,100 r/min~200 r/min振荡孵育2 h)。
 
2、使用Pipetty连续分液模式，每孔中加满洗涤缓冲液，放置30 s后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板。
3、ELISA板第1列A、B两孔加O型抗原,第2列A、B两孔加A型抗原，第3列A、B两孔加 Asial型抗原，以此类推，其余孔加被检样品，每份样品每个血清型加2孔，每孔加50uL。每型设2孔阴性对照,阴性对照孔每孔加50uL样品稀释液。用封板膜封板，置于38℃±0.5℃旋转振荡器中振荡60min，洗涤。
4、加豚鼠抗血清和兔抗豚鼠IgGHRP标记物或加各型抗FMDV型特异性单克隆抗体工作液:将工作浓度的豚鼠抗FMDV各型抗血清逐个加入与包被兔抗FMDV血清同型的各孔，即包被兔抗O型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗O型FMDV抗血清，包被兔抗A型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗A型FMDV抗血清,以此类推，使用连续分液模式，每孔加50uL，封板后同前振荡孵育60min。洗涤后加兔抗豚鼠IgG HRP标记物,每孔加50 uL，封板后同前振荡孵育45 min,洗涤。或者将工作浓度HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体加入到包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔，连续分液模式，每孔加50uL，封板后同前振荡孵育60min，洗涤。
 
5、加底物溶液、终止液，判读结果加豚鼠抗FMDV各型抗血清和兔抗豚鼠IgGHRP标记物时,洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的OPD底物溶液,连续分液模式，每孔加50uL，封板,避光38 ℃±0.5℃振荡孵育15 min。每孔加 50uL 1.25 mol/L终止液，混匀后在酶标仪492nm 下判读结果。加HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体时,洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的TMD底物溶液，每孔加 50uL,封板，避光38 ℃±0.5 ℃振荡孵育15 min。每孔加50uL 2 mol/L硫酸终止液，混匀后在酶标仪450nm下判读结果。

• 试验成立条件

结果计算:相对OD值=被检样品各血清型平均OD值一同型阴性对照(N)平均OD值。
某型阴性对照(N)平均OD值＞0.20,试验不成立。
阳性对照OD值应≥0.6,阴性对照应≤0.20,试验成立。

• 结果判定

1. 在试验成立的前提下:如果样品各型的相对OD值≤0.20,则该样品为阴性;
2. 如果样品某型的相对OD值≥0.3.则判定该样品此血清型阳性;
3. 如果样品某型的相对OD值＞0.2但＜0.3,则判为可疑，需要重新测定,再次测定结果，若某型的相对OD值＜0.30,则该样品为阴性，如果样品某型的相对OD值≥0.3,则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性。