方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫3ABC-I-ELISA全流程，依托 Pipetty 电动移液器精准移液、微量分液及程序记忆等核心优势，对批量加样、梯度稀释、微量试剂添加等关键步骤进行优化。仪器匀速稳定的吸排液与精准控量，可有效避免手动操作中力度不均、速率不一及手部抖动造成的体积偏差，减轻长时间实验疲劳，提高检测重复性与孔间均一性，确保实验结果稳定可信，为口蹄疫血清抗体检测、疫病筛查及流行病学监测提供标准化、可追溯的操作方案，显著提升检测效率、减少实验误差、规范检测流程。
 
方案详情：
一、实验原理
      猪口蹄疫 3ABC-I-ELISA 采用间接 ELISA 原理，以口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC 为包被抗原，特异性识别感染后产生的抗体。待检血清加入后，特异性抗体与固相抗原结合，再加入酶标二抗进行反应。洗涤后加入底物显色，颜色深浅与血清中抗体含量正相关。该方法可区分感染猪与免疫猪，适用于野毒感染筛查、净化评估及流行病学监测，具有特异性强、灵敏度高、适合批量检测的特点。
二、试验设备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
 
2、试剂
① 阴性对照血清；
② 阳性对照血清；
③ 洗涤缓冲液；
④ 25倍浓缩 PBS缓冲液；
⑤ 兔抗牛、羊或猪IgG-HRP酶结合物，使用时用血清稀释液稀释至工作浓度。
⑥ 血清稀释液；
⑦ TMB底物溶液；
⑧ 终止液:0.3mol/L硫酸；
⑨ 纯化的3ABC蛋白。
 
      
 
三、实验步骤
1、使用Pipetty电动移液器5-1000量程，血清稀释板每孔加入血清稀释液120uL，然后用1-250量程，依次加入阳性对照血清、阴性对照血清和待检血清，每孔6uL(1:21倍稀释);标准阴、阳性对照血清平行加两孔，待测血清加1孔，留两孔不加血清作为空白对照，轻振混匀;然后，将稀释好的血清按对应的位置转移至包被3ABC抗原的ELISA板上，每孔100uL，用封口膜封口，37°C结合30min。
 
2、去掉封口膜，每孔加满洗涤缓冲液，洗涤5次，最后一次拍干。
3、准备工作浓度的酶结合物，使用Pipetty每孔加入100uL，用封口膜封口，37°C结合30min。
4、去掉封口膜，每孔加满洗涤液，洗涤5次，最后一次拍干。
5、用Pipetty电动移液器，每孔加入100uL TMB底物，封口膜封口，37°C避光作用10min~15min。显色过程中监测OD_630nm值接近0.7时终止反应。
 
6、用Pipetty每孔加入100uL终止液(终止后测定阳性对照孔OD_450nm值应小于2.1)。
7、轻轻摇振混匀，测定波长450nm吸光值15.3.7
 
四、试验成立条件
      阳性对照平均OD_450nm值应大于0.6;阴性对照平均OD_450nm值应小于0.2。
五、结果判定

1. 样品效价=(ODOD_450nm样品一ODOD_450nm阴性对照)÷(ODOD_450nm阳性对照一ODOD_450nm阴性对照)。
2. 被检血清样品效价小于0.2,判为阴性。被检血清样品效价大于或等于0.3.判为阳性。被检血清样品效价介于0.2~0.3之间为可疑;可疑样品复测效价大于或等于0.2,则判定为阳性。