方案摘要：本方案覆盖动物沙门氏菌PCR检测全套试验流程，依托Pipetty电动移液器精准定量、程序记忆特性，标准化优化核酸制备、试剂配制、体系加样等关键实验步骤。基于沙门氏菌stn特异性基因扩增原理，通过高精度移液设备规避人工操作误差、减轻连续实验操作负担，保障PCR反应体系配比精准、实验条件稳定。有效提升检测重复性与批次一致性，规范整套核酸检测操作标准，为动物沙门氏菌感染筛查、疫病流行病学调查及常态化监测工作，提供精准高效、质量可控的技术支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
本检测基于沙门氏菌特异性基因序列，运用 PCR 扩增技术判定样本带菌情况。先对增菌样品或可疑菌落处理提取基因组 DNA 作为模板，采用 stn 特异性引物扩增目标片段。通过变性、退火、延伸循环反应扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离成像。结合阴阳及空白对照结果比对，样本出现 260bp 特征条带即为沙门氏菌阳性，无对应条带则判定为阴性，可快速完成沙门氏菌定性筛查。
 
二、实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 高速离心机；
③ 恒温水浴锅；
④ PCR 扩增仪；
⑤ 琼脂糖凝胶电泳仪；
⑥ 凝胶成像系统；
⑦ 电子天平；
⑧ 离心管；
⑨ 96孔板。
 
2、试剂
① XLT4培养基；
② 0.5×TAE电泳缓冲液；
③ 1.2%琼脂糖凝胶；
④ 蒸馏水；
⑤ 无核酸酶水(ddH₂O)；
⑥ PCR Master Mix；
⑦ RT-qPCR Master Mix；
⑧ 细菌DNA提取试剂盒；
⑨ 核酸染料；
⑩ Marker；
⑪ 10×DNA凝胶加样缓冲液；
⑫ 大肠杆菌标准株(ATCC25922)；
⑬ 鼠伤寒沙门氏菌标准株(ATCC19585)；
⑭ 缓冲蛋白胨水(BPW)；
⑮ RVR10培养基；
⑯ MSRV培养基。
 
三、实验步骤
1、吸取样品经BPW增菌培养后的液体1mL，12000 r/min离心5min，用移液枪缓慢吸掉上清液(尽量避免吸取菌体沉淀)，沉淀用1mL无菌去离子水离心洗涤1次，用无菌去离子水重悬沉淀至200uL；或者挑选XLT4平板疑似沙门氏菌菌落(每个样本至少同时选择3个菌落)重悬至200uL无菌去离子水中。煮沸法（沸水浴10min，12000 r/min离心5min，吸取上清液）或使用商品化基因组提取试剂盒提取其基因组DNA作为PCR模板。
2、PCR反应体系为:2×PCR Master Mix 12.5 uL，上游引物stn1和下游引物st2(2.5pmol/L)各1 uL，模板DNA 2 uL，无菌去离子水8.5uL。使用Pipetty电动分液器自动混匀模式将PCR反应体系进行预混，再设置连续分液模式，加入到96孔板中，并分别采用沙门氏菌标准株基因组DNA、大肠杆菌标准株基因组DNA、灭菌去离子水作为阳性、阴性和空白对照。
 
 
3、PCR反应程序:94℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，25 个循环；72℃延伸 10 min，反应结束后立即电泳，或将扩增产物置于4℃保存。
4、使用Pipetty，取10uL的PCR产物，于1.2%琼脂糖凝胶中，130 V电压电泳45min，在凝胶成像仪中观察结果并拍照。
 
5、如阳性对照扩增出260bp左右的片段同时阴性对照和空白对照均未扩增出260bp左右的片段，则PCR反应判定为有效；如阳性对照未扩增出260 bp左右的片段，或者阴性对照和空白对照任一扩增出260bp左右的片段，则反应无效。
 
四、结果判定
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确的情况下，如样品扩增出260bp左右的条带，则判定样品为阳性；如样品未出现260bp左右的条带，则样品判定为阴性。