方案摘要：本方案完整涵盖猪圆环病毒分离整套实验流程，依托 Pipetty 电动移液器高精度定量、程序储存等核心功能，优化试剂稀释、批量加样等关键步骤。设备移液量精准可控，吸排液运行平稳，有效减少人工操作带来的误差，降低长时间实验操作疲劳度。大幅提升实验重复性与操作均一性，稳定把控实验质量，标准化操作流程，为动物疫病分离鉴定、流行病学调查及病原监测工作提供高效、可靠的技术支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
基于病毒的细胞嗜性与体外增殖特性。采集病猪淋巴结、肺脏等含毒组织，研磨制成悬液，经冻融、离心、滤膜除菌后，接种PK-15 细胞。病毒吸附侵入细胞，利用宿主系统复制装配。经 D - 氨基葡萄糖处理促进增殖，盲传数代后，通过PCR 或免疫荧光鉴定病毒。核心是在敏感细胞内扩增病毒并排除杂菌，获得纯毒株。
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 生物安全柜；
③ 二氧化碳培养箱；
④ 倒置荧光显微镜；
⑤ 台式低速离心机；
⑥ 组织匀浆机或研磨器；
⑦ 细胞培养瓶；
⑧ 96孔细胞培养板。
 
 
2、试剂
① MEM；
② PBS；
③ 4%多聚甲醛；
④ 细胞生长液；
⑤ 细胞维持液；
⑥ 300mmol/LD-氨基葡萄糖；
⑦ 0.1%TritonX-100；
⑧ 3%BSA；
⑨ 3%H₂O₂-甲醇溶液；
⑩ 小鼠抗PCV2单克隆抗体；
⑪ FITC-山羊抗小鼠IgG抗体；
⑫ DAPI染色液；
⑬ HRP-山羊抗小鼠IgG抗体；
⑭ AEC显色试剂盒；
⑮ PK-15细胞。      
 
三、实验步骤
1、组织样品经研磨后，按照1:9的比例加入MEM培养基，制成10%的组织悬液，反复冻融3次,经12000r/min离心15 min,取上清液，使用0.22um滤膜过滤，收集滤出液备用。血清样品直接使用0.22pm滤膜过滤，收集滤出液备用。
2、用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层，使用Pipetty电动移液器一键混匀模式，用细胞生长液将PK-15细胞稀释为1×106个/mL,备用。
 
3、将处理过的样品上清液按照1:5的比例接种到新消化的PK-15细胞悬液中，置于37℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱静置培养24h。同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。
4、待细胞长至单层时，弃掉旧的培养液，用PBS清洗2次，弃净，加入适量300mmol1/LD-氨基葡萄糖(以能完全覆盖细胞单层为准),于37℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱作用30 min;用 PBS 清洗2次，弃净。
5、使用Pipetty，加入细胞维持液，继续培养48h。收集细胞与上清液，反复冻融3次，此为第一代病毒培养物。
 
6、由于PCV2接种不出现细胞病变效应,盲传5代。收获第5代病毒的细胞培养物悬液,反复冻融3次，2000r/min离心20min，吸取上清液,进行病毒鉴定。
 
四、结果判定
细胞连续盲传培养后，结合病变与检测综合判定。若 PK-15 细胞出现轻微聚集、萎缩等特异性病变，且经 PCR、免疫荧光检测可检出猪圆环病毒核酸或抗原，判定病毒分离阳性。细胞生长状态正常、无异常病变，配套检测指标均为阴性，则判定分离阴性。若细胞污染、脱落严重，对照实验失效，本次分离试验无效，需重新开展分离操作。