方案摘要：本方案完整涵盖猪圆环病毒PCR试验全流程，借助 Pipetty 电动移液器精准定量、程序记忆等性能优势，对试剂混匀、大批量加样等关键实验步骤做标准化优化。设备移液精度高、稳定性强，可大幅降低入工移液带来的误差，同时缓解连续实验的手部操作负担。有效提升试验重复性与批次一致性，规范整套检测操作标准，为猪圆环病毒病原鉴定、流调监测及日常常态化检测，提供精准高效、质量可控的实验支撑。
方案详情：
一、实验原理
猪圆环病毒荧光定量 PCR，依据病毒保守基因设计特异性引物与荧光探针，通过变性、退火、延伸温控循环，对样本中病毒核酸进行体外指数扩增。扩增时探针结合靶基因释放荧光信号，仪器实时监测信号累积变化，依据扩增曲线与 Ct 值判定阴阳性。该方法特异性强、灵敏度高、检测快速，适用于病原鉴定、隐性带毒筛查及猪场流行病学监测与常态化疫病检测。
二、实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② PCR仪；
③ 台式高速冷冻离心机；
④ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑤ 凝胶成像仪(或紫外透射仪)；
⑥ PCR管；
⑦ 2℃~8℃冰箱；
⑧ -20℃冰柜；
⑨ 微波炉。
 
2、试剂
① PBS；
② DNAzol；
③ 无水乙醇；
④ 75%乙醇；
⑤ 8 mmol/L NaOH；
⑥ 10×PCR buffer；
⑦ dNTPs；
⑧ Taq 酶(5U/uL)；
⑨ 无核酸酶水；
⑩ 1×TAE缓冲液；
⑪ 1.5%~2%琼脂糖凝胶；
⑫ 6×上样缓冲液；
⑬ DNA 分子质量标准；
⑭ 阳性对照；
⑮ 阴性对照；
⑯ 引物。
 
三、实验步骤
1、样品制备：取待检组织样品约1g~3g置于组织匀浆机中充分研磨，用PBS制备成10%的组织匀浆液。2 000r/min离心10min，取上清液，待检。血清样品可直接用于检测。
2、核酸提取
a） 取n个灭菌的1.5mL离心管,其中n为待检样品数+阳性对照数十阴性对照数，对每个离心管进行编号。
b) 每管先加入800uL DNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200uL,振荡混匀15 s,2 ℃~8 ℃或室温 10 000 r/min 离心10 min。
 
c) 取900uL上清液，置于新的1.5mL灭菌离心管中,加入500uL无水乙醇，混匀，室温放置3 min;2 ℃~8 ℃或温 10 000 r/min 离心 5 min.
d) 弃上清液,沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇,颠倒3次~6次混匀，2℃~8℃10 000r/min离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器吸去残液。
e) 用30uL 8mmol/LNaOH溶液溶解沉。DNA在2℃~8℃可保存两个月,-20℃可稳定保存两年。
2、反应体系配制
使用Pipetty 自动混匀功能按照表1预混 PCR反应体系，再设置连续分液功能，批量加入到96孔板中，每次扩增应设置阳性对照和阴性对照。
 
 
3、反应程序设置
将试剂充分混匀，盖紧PCR管盖，瞬时离心后，置于PCR仪中进行扩增。扩增程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性 30 s,56 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,35个循环;72 ℃终延伸10 min。
4、扩增产物电泳
将5uL 6×上样缓冲液加入至上述PCR产物中，混匀。取8uL加入1.5%~2%琼脂糖凝胶泳道孔内，同时加入DNA分子质量标准作为对照，100 V~120 V稳压电泳30 min~40min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。
四、实验成立条件
阳性对照应有大小约为269 bp的特异性扩增条带，且阴性对照无任何扩增条带。
五、结果判定
被检测样品出现大小约为269 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带分子量大小相符，则判定为PCV2核酸阳性;被检样品无特异性扩增条带，则判定为PCV2核酸阴性。必要时,可取扩增产物用特异性引物进行序列测定,并与PCV2特异性扩增片段序列进行核苷酸同源性比对分析，以确证检测结果。