方案摘要：本方案涵盖动物沙门氏菌荧光 PCR 全检测流程，借助 Pipetty 电动移液器精准移液、程序记忆优势，规范核酸提取、试剂调配、样本加样等核心步骤。依托沙门氏菌 stn 特异性基因扩增原理开展检测，设备可减少人工操作偏差，降低作业疲劳度，保证反应体系配比精准、实验环境稳定。有效提升检测重复性与结果统一性，标准化检测操作，为动物沙门氏菌筛查、疫病调研及日常监测提供可靠高效的技术保障。
 
方案详情：
一、实验原理
提取动物样本中沙门氏菌核酸，利用特异性引物与探针靶向结合菌体保守基因。扩增过程中荧光基团随基因片段复制同步释放荧光信号，仪器实时监测荧光强度变化。依据信号扩增曲线判定样本是否含沙门氏菌，可快速完成定性筛查，兼具灵敏度高、特异性强、检测周期短的特点，适用于畜禽组织、粪便等样品沙门氏菌快速检测。
二、实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 高速离心机；
③ 恒温水浴锅；
④ PCR 扩增仪；
⑤ 琼脂糖凝胶电泳仪；
⑥ 凝胶成像系统；
⑦ 电子天平；
⑧ 离心管；
⑨ 96孔板；
⑩ 实时荧光定量 PCR 仪。
 
2、试剂
① XLT4培养基；
② 0.5×TAE电泳缓冲液；
③ 1.2%琼脂糖凝胶；
④ 蒸馏水；
⑤ 无核酸酶水(ddH₂O)；
⑥ PCR Master Mix；
⑦ RT-qPCR Master Mix；
⑧ 细菌DNA提取试剂盒；
⑨ 核酸染料；
⑩ Marker；
⑪ 10×DNA凝胶加样缓冲液；
⑫ 大肠杆菌标准株(ATCC25922)；
⑬ 鼠伤寒沙门氏菌标准株(ATCC19585)；
⑭ 缓冲蛋白胨水(BPW)；
⑮ RVR10培养基；
⑯ MSRV培养基。
 
三、实验步骤
1、可使用未增菌处理的样品模板结合标准曲线进行定量检测，也可使用未增菌或增菌处理后的样品模板进行定性检测。未增菌处理样品以水样等液体样品为主，增菌处理样品为经BPW增菌培养后的液体或分离纯化的疑似沙门氏菌菌落，用商品化基因组提取试剂盒或煮沸法提取样品中基因组 DNA作为PCR模板。
2、RT-gPCR引物和探针序列见表2，其中stn 引物序列与普通PCR相同，两者可通用。RT-qPCR反应体系为:2×PCR Master Mix 12.5 uL,上游引物stnl和下游引物stn2(10 umol/L)各0.5 uL,荧光探针(3 umol/L)1.0uL,ROX Reference Dye 0.5 uL,模板 DNA2.0 uL,无菌去离子水 8.0 uL。使用Pipetty电动移液器，一键混匀功能将试剂预混，连续分液功能，快速加入到96孔板中，并设置阳性、阴性和空白对照。
 
 
3、在荧光定量PCR仪中设置如下反应程序进行扩增:95℃预变性10 s;95℃ 10 s，60℃34s,40个循环。反应结束后，对获得的信号数据进行处理。
 
4、细菌培养后平板计数确定细菌浓度，通过10倍梯度稀释制备一定浓度梯度的DNA模板，进行RT-qPCR扩增，得到相应的扩增曲线，绘制反映Ct值随细菌数量变化的标准曲线，用于样品中沙门氏菌量的估算。
5、以下条件有一条不满足时，试验视为无效，需重新进行试验:
a) 空白对照:无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0或无Ct值;
b) 阴性对照:无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0或无Ct值;
c) 阳性对照:有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0;
d) 标准曲线:标准品扩增获得的标准曲线，各参数应与本方案提供的接近。
 
四、结果判定
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确的情况下，如样品Ct≤36判定为阳性，36