方案摘要：本方案完整涵盖猪圆环病毒过氧化物酶单层细胞试验全流程，借助 Pipetty 电动移液器精准定量、程序记忆等性能优势，对试剂梯度稀释、大批量加样等关键实验步骤做标准化优化。设备移液精度高、稳定性强，可大幅降低人工移液带来的误差，同时缓解连续实验的手部操作负担。有效提升试验重复性与批次一致性，规范整套检测操作标准，为猪圆环病毒病原鉴定、流调监测及日常常态化检测，提供精准高效、质量可控的实验支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
猪圆环病毒过氧化物酶单层细胞试验（IPMA），以 PK-15 单层细胞培养增殖 PCV 病毒并固定抗原，利用抗原抗体特异性结合原理，先与 PCV 特异性一抗结合，再结合辣根过氧化物酶标记二抗。通过酶催化底物显色，显微镜下观察细胞有无特异性着色判定结果。该方法弥补 PCV 无明显细胞病变的不足，特异性强、操作简便，适用于猪圆环病毒分离鉴定、临床抗原及血清抗体检测与疫苗免疫效果评价。
二、实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 生物安全柜；
③ 二氧化碳培养箱；
④ 倒置荧光显微镜；
⑤ 台式低速离心机；
⑥ 组织匀浆机或研磨器；
⑦ 细胞培养瓶；
⑧ 96孔细胞培养板。
 
2、试剂
① MEM；
② PBS；
③ 4%多聚甲醛；
④ 细胞生长液；
⑤ 细胞维持液；
⑥ 300mmol/LD-氨基葡萄糖；
⑦ 0.1%TritonX-100；
⑧ 3%BSA；
⑨ 3%H₂O₂-甲醇溶液；
⑩ 小鼠抗PCV2单克隆抗体；
⑪ FITC-山羊抗小鼠IgG抗体；
⑫ DAPI染色液；
⑬ HRP-山羊抗小鼠IgG抗体；
⑭ AEC显色试剂盒；
⑮ PK-15细胞。      
 
三、实验步骤
1、消化对数生长期的 PK-15细胞,使用Pipetty电动移液器的一键混匀功能，用细胞生长液稀释成1×105个/mL，切换连续分液模式，等量加入100uL/孔铺于96孔细胞培养板。
2、使用Pipetty将待检病毒液接种长至单层的PK-15细胞，100uL/孔。同时设置已知PCV2病毒接种孔作为阳性对照，100uL/孔;设置细胞维持液接种孔作为阴性对照，100uL/孔。
 
3、将细胞培养板置于37℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱中孵育1h，弃去病毒液，用PBS清洗2次，3min/次，弃净，每孔加入细胞维持液 100uL,继续培养48h。
4、弃上清，用PBS冲洗细胞3次，每孔加入100uL 4%多聚甲醛,室温固定20min,弃液，PBS冲洗细胞3次，每次3min,轻轻拍干。
5、使用Pipetty每孔加入100uL 0.1% Triton X-100室温透膜 10 min,弃液,用PBS冲洗细胞3次，3min/次，轻轻拍干。
6、每孔加入100uL 3% H₂O₂-甲醇溶液，37℃处理10 min,弃液，用PBS冲洗细胞3次，3min/次，轻轻拍干。
7、用Pipetty每孔等量加入100uL 3% BSA溶液，37℃封闭1h,弃上清液。
8、每孔等量加入50uL小鼠抗PCV2单克隆抗体(稀释至工作浓度)，37℃作用1h，弃液，用PBS冲洗细胞3次，3min/次，轻轻拍干。
 
9、每孔等量加入50uL HRP-山羊抗小鼠IgG(稀释至工作浓度),37℃孵育30 min,用PBS冲洗细胞3次，每次3min，轻轻拍干。
10、用AEC显色试剂盒显色20 min,PBS冲洗细胞3次,3 min/次,轻轻拍干。将96 孔细胞培养板置于倒置显微镜下观察。
四、实验成立条件
阳性对照细胞呈现特异性红色染色，且阴性对照细胞无特异性红色染色。
五、结果判定
被检病毒接种的细胞呈现特异性红色染色，判定为PCV2阳性；被检病毒接种的细胞无特异性红色染色，判定为PCV2阴性。